アネキシンV結合アッセイ:ホスファチジルセリン標識を介してアポトーシス赤血球を同定する蛍光ベースの技術

特定の病理学的状態では、赤血球または赤血球は、膜リン脂質(ホスファチジルセリン)の内膜リーフレットから外膜リーフレットへの転座を伴う細胞収縮を起こし、プログラムされた細胞死、エリプトーシスを引き起こし、マクロファージを介した細胞食作用を引き起こします。

アネキシンV結合アッセイを介して単離されたヒト赤血球集団におけるイオノフォア誘発性エリプトーシスを測定するには、グリコースフリーバッファーに懸濁した赤血球から始めます。

グルコースの枯渇は細胞ストレスを誘発し、細胞質ゾルプロテインキナーゼCを活性化し、その後カルシウムチャネルを活性化し、カルシウムイオンの流入を引き起こします。さらに、カリウムチャネルが活性化され、カリウムの流出と細胞収縮を引き起こします。

次に、細胞外カルシウムイオンと安定した複合体を形成するカルシウムイオノフォアを添加します。この複合体は、細胞膜を通るカルシウムイオンの細胞質ゾルへの侵入を促進し、細胞内カルシウム濃度をさらに増加させます。これにより、スクランブラーゼ(双方向のリン脂質トランスポーター)が活性化され、ホスファチジルセリンの内側から外側の細胞膜リーフレットへの転座を助け、膜の非対称性を減らし、角痂を誘発します。

イオノフォア処理した赤血球を遠心分離します。細胞をカルシウム含有結合緩衝液に再懸濁します。蛍光色素結合アネキシンV溶液を加えます。

高いホスファチジルセリン親和性を有するカルシウム依存性リン脂質結合タンパク質アネキシンVは、外細胞膜リーフレット上の露出したホスファチジルセリン残基に結合

蛍光活性化細胞ソーティングを使用して、アネキシンV蛍光強度に基づいて赤血球集団を分離します。エリプトーシス赤血球は、健康な赤血球よりも高いアネキシンV蛍光強度を示します。

2ミリリットルの5XアネキシンV結合バッファーを8ミリリットルのPBSで希釈して、1X結合バッファーを取得します。イオノマイシン処理および未処理の細胞ペレットを1ミリリットルの1X結合バッファーに再懸濁します。

結合バッファーに235マイクロリットルの細胞懸濁液を取り、15マイクロリットルのアネキシンV-Alexa Fluor 488複合体を微量遠心チューブに加えます。細胞を室温で暗所で20分間インキュベートします。

温で700 x g で5分間遠心分離します。上清を取り除きます。細胞ペレットを1.5ミリリットルの結合バッファーに懸濁し、室温で700 x g で5分間遠心分離することにより、細胞を1X結合バッファーで2回洗浄します。

上清を取り除き、フローサイトメトリー測定のために細胞ペレットを250マイクロリットルの1X結合バッファーに再懸濁します。次に、200マイクロリットルのアネキシンV染色赤血球をフローサイトメトリーと互換性のある1ミリリットルの丸底ポリスチレンチューブに移します。

フローサイトメトリーソフトウェアにログインし、「新規実験」ボタンをクリックします。「新しいチューブ」ボタンをクリックし、「グローバルシート」を選択し、「分析の適用」を選択して、励起波長488ナノメートル、発光波長530ナノメートルの蛍光強度を測定します。

蛍光活性化細胞選別分析のために収集する細胞数を20,000に設定します。目的のチューブを選択し、「ロード」ボタンをクリックします。「記録」ボタンをクリックして、前方散乱および側面散乱測定を行います。すべてのサンプルについて繰り返します。

試料」ボタンを右クリックし、「バッチ分析の適用」をクリックして結果ファイルを生成します。「標本」ボタンを右クリックし、「FSCファイルの生成」をクリックします。