無菌実験技術：めっき法

[ナレーター] このプロトコルでは、細菌やファージなどの微生物を単離、増殖、または計数するために用いられる塗布方法における無菌操作について説明します。手順には、単一コロニーを単離するための細菌培養物の画線塗布、細菌濃度を決定するための分注平板法、および生存細菌コロニーを計数するための塗布平板法が含まれます。ソフトアガーオーバーレイ法は、ファージの単離とプラークの計数に用いられ、レプリカ平板法は、同一の空間的パターンで細胞をあるプレートから別のプレートへと転移させます。最終的に、これらの微生物培養手法の実用的応用は、環境中の細菌の同定から、分子遺伝学やハイスループットバイオアッセイにおける技術的進歩まで多岐にわたります。

一般的に、これらの播種法に慣れていない方は、非滅菌表面への接触を避けながら、慎重かつ協調的な動作で操作を行う必要があるため、習得に苦労することがあります。これらのルーチン操作を習得するには、トレーニングと練習が必要です。以下では、研究室コーディネーターのKris Reddi博士が手順を実演します。

- [ナレーター] バイオハザード分類、廃棄物の除染および廃棄を含む、研究室の規則と安全上の注意事項を把握した上で、微生物の取り扱いを開始します。プレート作成手順に使用するすべての器具、溶液、培地が滅菌されていることを確認してください。また、明確な作業スペースを確保し、消毒剤で清浄します。ガスラインに接続されたブンゼンバーナーを設置し、適切にラベルを貼った材料と共に必要な備品を配置します。次に、抗菌石鹸と温水で手を十分に洗います。まず、温かい流水で手を濡らし、石鹸を塗布して十分に広げます。親指、指の背面、手の甲、爪の下を含むすべての表面に摩擦を加えるように、力強く手をこすります。その後、残った石鹸を完全に洗い流し、ホルダーから取り出したペーパータオルで拭き取ります。最後に、新しいペーパータオルを使用して蛇口を閉めます。 画線平板法（ストリークプレート法）は、単純な機械的分離によって、混合集団から細菌の純粋培養物、すなわちコロニーを分離するために設計されています。4 °Cのコールドボックスから寒天プレートを取り出し、室温まで予熱します。プレートの画線に使用する器具を選択します。蓋に結露がなく、プレートが乾燥していることを確認してください。寒天プレートの底面の縁に沿ってラベルを貼ります。習熟している場合は、1枚のプレートで複数のサンプルを使用します。次に、ブンゼンバーナーに点火し、金属ループを火炎滅菌します。ワイヤーの先端をブンゼンバーナーの炎の最も熱い部分である青い円錐の中に向け、ループから3〜4インチ離れた位置から開始します。金属が赤熱したら、火炎がループに近づくようにワイヤーを動かします。ループを冷却するために、寒天培地の端に触れさせ、ジューという音をさせます。そのままループで接種物を採取します。プレートの下半分を持ち上げます。プレートの第1区画において、縁から中心に向かってループを往復させます。プレートを再び蓋の上に伏せて置きます。金属ループを再滅菌します。ペトリ皿を90度回転させます。第1区画の最後の画線の末端付近にループを触れさせ、往復パターンを用いて、第1区画の画線の最後の半分と交差させ、その後、空白の第2区画へと移動します。第2区画が塗りつぶされたら、プレートを置きます。第1区画との接触を避けながら、第3および第4区画に対しても同様の画線手順を繰り返します。滅菌済みの平らな爪楊枝で画線する場合、細い端を親指と薬指で軽く持ち、培地に対して10〜20度の角度に合わせ、太い端を使用して各区画を画線します。区画の間でプレートを再び蓋の上に伏せて置き、爪楊枝を適切に廃棄します。画線を終えたプレートを倒立させて培養します。 分注平板法（プールプレート法）は、単一のプレートの表面および寒天内部にあるコロニー形成単位の総数を数えます。タイマーを10分に設定し、55 °Cのウォーターバスから48 °Cのヒートブロックに18 mLの融解寒天培地を移し、10分間平衡化させます。滅菌済みのペトリ皿の底面にラベルを貼ります。必要に応じて希釈倍率を記入します。次に、サンプルの1 mLをペトリ皿の中央に分注します。蓋を閉めます。融解寒天のチューブからキャップを取り外し、開いたチューブの縁を火炎に通します。寒天を注意深くペトリ皿に注ぎます。蓋を閉め、プレートをゆっくりと回転させてサンプルと寒天を混ぜ合わせます。寒天が凝固するまで30分待ちます。寒天が凝固した後、プレートを倒立させて温室に置きます。 塗抹平板法（スプレッドプレート法）は、少量のサンプルに含まれる微生物を分離し、得られたコロニーを寒天表面に均等に分布させることを目的としています。プレートを室温で平衡化させ、適切にラベルを貼ります。プレートをターンテーブル上に配置します。サンプルの0.1 mLを寒天の中心にピペッティングし、蓋を閉めます。チップを廃棄容器に捨てます。金属製スプレッダーを70%エタノールのビーカーに浸し、スプレッダーの底面全体とステムの最初の1インチまでを覆い、その後、液を切ります。ブンゼンバーナーの火炎に通して、余分なエタノールを燃やします。次に、寒天プレートの蓋を開け、縁に近い端の寒天にスプレッダーを触れさせて冷却します。ターンテーブルをゆっくりと回転させます。スプレッダーを寒天表面に軽く当て、ターンテーブルが回転している間に、往復運動を用いてサンプルをプレート全体に徐々に均一に広げます。蓋を閉め、サンプルが完全に吸収されるまで少なくとも5分間放置します。その後、プレートを倒立させて培養します。 まず、寒天プレートに適切にラベルを貼ります。寒天プレートの蓋を開けます。次に、滅菌済みのガラスビーズの容器を開け、縁を火炎滅菌します。10〜12個の滅菌済みガラスビーズを注意深く寒天プレート上に分注します。プレートの蓋を閉め、ガラスビーズ容器のキャップを戻す前に縁を火炎滅菌します。次に、サンプルの分注を寒天の中央に行います。水平方向の動きで、寒天表面上でビーズを7回、優しく振ります。正しく行われれば、マラカスを振っているような音がします。プレートを60度回転させ、再び水平方向に7回振ります。さらにプレートを60度回転させ、振る動作を繰り返します。サンプルが吸収されたことを確認します。その後、汚染されたビーズを10%塩素系漂白剤の入った標識付き回収ビーカーに注ぎ捨てます。プレートを倒立させて培養します。 プラークアッセイは、一般にバクテリオファージの検出と定量に使用されます。指示細菌を対数増殖期まで培養し、氷上に保存します。次に、2本の滅菌マイクロcentrifugeチューブに「phage」と「control」のラベルを貼り、それぞれ50 µLのファージサンプルまたはバッファーを加えます。次に、フラスコ内の細菌培養液を回し、細菌の一部分を滅菌チューブに移して指示細菌を軽くボルテックスし、各吸着チューブに500 µLの細菌を加えます。チューブを軽く弾いて混ぜ合わせます。ファージサンプルをボルテックスしたり、激しくピペッティングしたりしないでください。ファージと細菌の混合物を、指示菌株に適した温度で20分間インキュベートします。その間に、2本のソフトアガールチューブを55 °Cのウォーターバスから48 °Cのヒートブロックに移します。10分間平衡化させます。室温に予熱した、結露のない2枚の栄養ハードアガールプレートにラベルを貼ります。ヒートブロックからソフトアガールチューブを取り出し、内容物が触れないほど熱すぎないか確認します。次に、ファージ吸着チューブからソフトアガールチューブへ、混合物を無菌的に移します。その後、手のひらの間で急速に回転させて内容物を混ぜます。片手でチューブを持ち、もう一方の手でハードアガールプレートの蓋を開けます。すぐにチューブの全量をハードアガールプレートの表面に注ぎます。プレートを素早く、優しく揺らします。蓋を閉め、ソフトアガールが凝固するまで30分間、水平な場所にプレートを置きます。次に、コントロール吸着チューブの混合物をソフトアガールチューブに移し、混ぜ合わせ、ハードアガールプレートに注ぎ、揺らして30分間凝固させるという手順を繰り返します。プレートにプラークが形成されているか確認します。不均一な混合物からプラークを分離するには、滅菌爪楊枝で中心を注意深く突き刺し、接種物を100 µLのファージバッファーを含む滅菌マイクロcentrifugeチューブに移します。必要に応じて段階希釈を行い、プラークアッセイを3〜6回繰り返すことで、この溶出液をさらに精製します。 レプリカプレート法は、一次プレート上の細胞増殖を二次プレートと比較できるようにすることで、選択可能な表現型を利用します。プレートの底面にグリッドを書き、一次プレートにラベルを貼り、結果として生じる各正方形に番号を振ります。ここで、無菌操作を用いてビーカーから滅菌済みの爪楊枝を取り出し、各正方形の中心に細胞サンプルを軽く押し当て、爪楊枝を適切な廃棄容器に捨てます。一次プレートを培養します。一次プレートとすべての二次プレートを重ねます。プレートの下半分側面に方向標識を付けます。次に、包装から滅菌済みのベルベット布を取り出し、円筒形ブロックの上に置きます。次に、ホルダーを設置し、ホルダーの標識をブロックの標識と合わせます。ブロックとホルダーの方向標識を確認してください。次に、一次プレートから蓋を取り外します。プレートとブロックの方向標識を合わせます。寒天表面がベルベット布に接触するようにプレートを下げます。指先で一次プレートの背面を軽く、均一に押し下げ、慎重にブロックから持ち上げます。細胞の転写跡がベルベット上に確認できることを確認します。プレートに蓋を戻します。次に、二次プレートそれぞれに対して、ベルベット布上でのプロトコルを順番に繰り返します。一次プレートから転写されたベルベット上の細胞を用いて、最も不適切から最も適切な基質へと順序立てられた最大8枚の二次プレートに接種します。最後に、ポジティブコントロールとして、シリーズの最後のプレートには、テストしたすべての菌株が増殖するはずの寒天培地を使用します。倒立させたプレートをテープでまとめ、培養します。二次プレートの増殖を確認します。ブンゼンバーナーを消し、すべての備品を片付けます。汚染された実験着、ガラス器具、有害廃棄物を適切な廃棄容器に入れます。作業エリアを消毒剤で清掃します。最後に、抗菌石鹸と温水で手を十分に洗います。 Serratia Marcescensは、プロジギオシンと呼ばれる赤色の色素を産生するグラム陰性桿状プロテオバクテリアです。これは一般的に、浴室やシャワーカーテンなどで増殖しているのが見られます。この例では、ストリークプレート法により、第4区画に単一コロニーが形成されています。 公共の飲料水噴水から採取した水サンプルに含まれる細菌のこの分析では、分注平板法が使用されています。コロニーの外見の違いに注目してください。表面のコロニーは大きく円形であるのに対し、一部の表面コロニーは非常に小さく不規則な形をしています。 塗抹平板法は、濃縮、選択、およびスクリーニング実験における重要な構成要素です。例えば、Copacabana法は、組換えDNA技術における古典的なブルーホワイトスクリーニングの分化ツールとなります。 ファージT4は、宿主であるEscherichia coliに感染して溶菌させ、子孫ファージを放出する毒性の強い二本鎖DNAファージです。EHA寒天上のこのプラークアッセイでは、直径約1 mmの透明な領域にファージが見られます。感染ファージ粒子が存在しない場合、細菌の増殖により、ソフトアガール内で細胞が濁った懸濁液となり、個々のコロニーは見えません。ソフトアガールオーバーレイ法では、プラークの形態が異なります。例えば、ここでは同じマイコバクテリア宿主菌株において、マイコバクテリアファージDestroyersの存在下とマイコバクテリアファージMSSSの存在下で、異なるプラーク形態が形成されています。 レプリカプレート法の強みは、多数の微生物を同時にスクリーニングできる点にあります。このケースでは、4つのシュードモナス菌株について、3種類の異なる炭素源（アセトアミド、ラクトース、グリシン）上での増殖を2回ずつテストしました。ここで、一次プレートは、示された4つの菌株を接種した完全YTA培地です。これらの菌株は、単一の炭素源（アセトアミド、ラクトース、またはグリシン）を添加した最小MSA培地のレプリカプレート上で、多様な増殖パターンを示しています。すべての菌株が最後のポジティブコントロールプレートで増殖しており、このシリーズのすべての二次プレートに細胞が転写されたことが確認できます。これらのレプリカプレートの結果をまとめた表は、異なる野生型菌株の特性的な増殖要求に関する同時スクリーニングの詳細を示しています。

- このビデオを視聴することで、培地や培養物を汚染させることなくプレーティング操作を行う方法、および研究室でのあらゆる実験課題に対して適切なプレーティング法を選択して使用する方法について、十分に理解することができます。これらの技術に習熟するには練習が必要です。しかし、適切なトレーニングを積めば、このビデオで解説するプレーティング操作は、実験台での作業において自然に身につくでしょう。