$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
蛍光標識好中球を含むマルチウェルプレートから始めて、抗好中球細胞質抗体を含む患者血清で処理します。
これらの抗体は好中球のFc受容体と相互作用し、シグナル伝達経路を活性化し、活性酸素種またはROSを生成し、ペプチジルアルギニンダイミナーゼを活性化します。
ROSは好中球の脱顆粒を引き起こし、酵素(エラスターゼとミエロペルオキシダーゼ)を細胞質に放出します。これらの酵素と活性化されたペプチジルアルギニンデイミナーゼは核に移動します。
エラスターゼはヒストン-H1を切断し、ミエロペルオキシダーゼはヒストンを修飾し、クロマチンの脱縮縮を開始します。活性化されたペプチジルアルギニンデイミナーゼはヒストンのシトルリン化を誘導し、アルギニン残基をシトルリンに変換し、さらなる脱縮合に寄与します。
脱縮縮したクロマチンは、抗菌タンパク質や細胞質タンパク質などの細胞内タンパク質と混合します。その後、好中球の膜が崩壊し、細胞質タンパク質と混合された脱凝縮クロマチンが細胞外空間に放出され、好中球細胞外トラップ NET が形成されます。
NETの細胞外DNAにのみ結合する細胞不透過性DNA色素を追加します。蛍光顕微鏡下では、好中球は緑色の細胞外ウェブ状構造で赤く見え、NET形成が確認されます。
2%FCSを含むフェノールレッドフリーRPMI-1640培地で1ミリリットルあたり420,000細胞の密度で細胞懸濁液を作成します。90マイクロリットルに37,500個の好中球を黒色の96ウェル平底プレートの各ウェルに加えます。
次に、選択した刺激を10マイクロリットルを3回追加して、各ウェルで10%の濃度に達します。常に陰性コントロールを 3 回含めます。摂氏37度の暗所で30分から2、4、または6時間の範囲の所望の時間インキュベートします。次に、各ウェルに1マイクロモルの最終濃度に達するために、25マイクロリットルの5マイクロモルの不透過性DNA色素を添加するために必要な量の不浸透性DNA色素を調製します。
インキュベーション時間の終了の15分前に、25マイクロリットルの5マイクロモル不浸透性DNA色素を各ウェルに加えます。暗闇の中で摂氏37度で最後の15分間インキュベーションを続けます。この後、上清を非常に慎重に取り除き、必要に応じて保管します。100マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドを加えます。プレートを暗闇に置いて、すぐに次のセクションに進みます。
設定が完了したら、Zシリーズを選択します。ステップ数として 10 を選択します。ステップサイズとして3マイクロメートルを選択します。プレートを免疫蛍光共焦点顕微鏡にロードします。
[
実行]タブをクリックします。プレートの名前と説明を入力し、保管場所を選択します。取得する必要がある井戸を選択します。Texas RedとFitCの露光時間を選択し、Acquire Plateをクリックして取得を開始しますが、これにはプレートあたり約1時間かかります。
この後、[分析マクロ]を選択します。次に、W1 を選択し、しきい値を選択します。次に、目的のピクセル値を選択し、最後に 2 番目の ImageJ ウィンドウで W2 を選択し、目的のピクセル値のしきい値を選択します。スプレッドシートファイルの保存先を選択します。分析を実行し、ログファイルを保存します。