免疫不全マウスにおける生体工学ヒト微小血管ネットワーク

本手順の全体的な目的は、in vivoでヒト血管ネットワークを構築することです。まず、ヒト血液由来の血管内皮前駆細胞（ECFC）とヒト骨髄由来の間葉系幹細胞を培養します。次に、これら2種類の細胞をコラーゲンベースのゲルに混合し、免疫不全マウスの皮下に注入します。

7日後にインプラントを回収し、ヒト血管ネットワークの形成を評価します。最終的に、インプラント内部にヒト特異的な微小血管が存在することは、組織学的検査および免疫組織化学的染色によって確認できます。構築物を外科的に移植するなどの従来の方法と比較した本技術の主な利点は、LEDを用いた手法であるため、簡便かつ容易に実施でき、手術を必要としない点にあります。

まず、E CFCsのバイアル1本を解凍し、直ちに10 mLのDMEMが入った15 mLコニカルチューブ内で細胞を希釈します。細胞懸濁液を1200 RPMで5分間遠心分離し、細胞ペレットを10 mLの加温したEGM two培地で再懸濁します。次に、細胞を1%ゼラチンでコーティングした100 mm組織培養プレートに移し、加湿インキュベーターで一晩培養します。

翌朝、培地と未接着細胞を穏やかに吸引して除去します。次に、接着した細胞に10 millilitersの新鮮なE GM two培地を添加します。この操作を、コンフルエントな単層が形成されるまで数日間繰り返します。

次に、10 mLのPBSで細胞を洗浄します。PBSを2 mLのトリプシンEDTAに置き換え、プレートをインキュベーターに戻して5分間静置します。5分後、顕微鏡下でプレートを軽く叩き、細胞が剥離したかを確認します。

そうでない場合は、緩やかに揺らしながら短時間のインキュベーションを繰り返します。細胞が完全に剥離したら、8 mLのEGM-2培地を細胞に加え、15 mLのコニカルチューブに移します。細胞数をカウントし、1200 RPMで5分間遠心分離します。

次に、1%ゼラチンでコートした組織培養プレートに、播種密度 5,000 cells/cm² で細胞を播種します。EGM-2培地を用いて細胞をインキュベートし、2〜3日ごとにEGM-2培地で継代・給餌を行ってください。継代4回目から8回目まで、この手順を繰り返します。

E CFCsが使用可能な状態になります。本プロトコールはMSCの培養にも適用可能です。E GM two mediumをM-S-C-G-M mediumに置き換えてください。

コートされていない培養プレートを使用します。コンフルエンスが80%に達した時点で継代を開始し、播種密度10,000 cells/cm²で継代します。この実験では、インプラント1つあたり800,000 E CFCsおよび1,200,000 MSCsが必要です。

通常、5つのインプラントを同時に調製します。まず、培養プレートから細胞培地を吸引し、各細胞プレートを10 millilitersのPBSで洗浄します。PBSを2 millilitersのtrypsin EDTAに置き換え、プレートを緩やかに揺らしながらインキュベートします。

すべての細胞が剥離するまで、2〜5分ごとに顕微鏡下で細胞を確認します。その後、8 mLのDMEMを加えて細胞懸濁液を回収します。15 mLコニカルチューブを用いて細胞数をカウントし、5つのインプラント分に相当する細胞を別の15 mLコニカルチューブに転移します。

次に、細胞を1200 RPMで5分間遠心分離し、上清を除去します。フィブリノゲンとコラーゲンフィブロネクチンの混合液を氷上で慎重に調製します。その後、細胞ペレットを氷冷した混合液の中で非常に緩やかに再懸濁します。

気泡が混入しないように注意しながら、細胞懸濁液を1 mLシリンジに充填し、キャップ付きの26G針を取り付けます。細胞混合液を注入するまで、充填したシリンジを氷上に保持します。イソフルランチャンバーを用いて、6週齢のアサイミック・ヌード免疫不全マウス4匹を麻酔します。

マウスを麻酔し、足指へのピンチ刺激に反応しなくなったことを確認後、各マウスへの注射を行います。30Gの針を用いて、50 µLのトロンビン溶液を背面上部に皮下注射します。同じ部位に、200 µLの細胞混合液を注射します。

26ゲージの針を用い、注入された高分子がゲル化して皮膚の下に小さく、しかし明確に認識できる隆起を形成させます。注入後、マウスをガーゼの上に置き、快適さと保温に配慮してください。マウスが自力で歩行できるようになるまで観察します。

その後3日間にわたり、動物の全身状態を毎日観察します。注射から1週間後、二酸化炭素でマウスを安楽死させ、外科的にゲルプラグを摘出します。回収後、定規と一緒にゲルプラグを撮影し、各ゲルプラグを組織用カセットに入れ、10%中性緩衝ホルマリンに浸して室温で一晩固定します。

翌日、10%中性緩衝ホルマリンを蒸留水で洗い流します。組織学的評価を行うまで、カセットをPBS中で4 °Cで保存します。パラフィンに埋め込まれたインプラントを7 µmの厚さで切片化します。

次に、インプラント中央部の微小血管密度を定量します。H&E染色を用いて、1mm²あたりの血管数を算出し、微小血管がヒト由来であることを証明します。切片を、市販の抗ヒトCD31抗体を1:100に希釈して染色してください。

この位相差顕微鏡像は、臍帯血由来eCFCの典型的なコンフルエント単層における内皮細胞の特徴的な石畳状の形態を示しています。この画像は、ヒト骨髄由来MSCの典型的な紡錘形形態を示しています。マウス宿主内で1週間培養した後、黄色の破線で示されたインプラントは、高倍率で観察すると宿主組織とは大きく異なって見えました。

赤血球を含む管腔構造を持つ複数の微小血管が認められ、黄色い矢尻で示されています。プラグを免疫組織化学的に検査したところ、微小血管の管腔はヒトCD 31に対するモノクローナル抗体に反応しました。細胞核はヘマチンで対比染色されました。

この技術を習得し、適切に実施すれば、1オンス以内で完了させることができます。