抗体の補体媒介性殺菌活性に関する血清殺菌アッセイ

陰性菌の外膜成分であるリポ多糖類(LPS)に対するモノクローナル抗体を含む連続希釈血清サンプルを採取します。

グラム陰性菌を導入します。血清抗体は細菌のLPSに結合します。

補体タンパク質を追加します。C1複合体はLPS結合抗体に結合し、酵素活性C1を形成します。

活性化されたC1はC4とC2を切断してC3コンバーターゼを形成し、C3を切断してC5コンバーターゼを形成します。転換酵素はC5を切断してC5bを生成し、C6とC7を動員します。得られた複合体は外膜に挿入され、C8および複数のC9と結合して細孔を形成します。

外膜の損傷は内膜を不安定にし、細胞溶解を引き起こします。

混合物を寒天プレートに置き、広げます。細菌の増殖のためにインキュベートします。微生物のデヒドロゲナーゼによって還元され、細菌のコロニーに赤い色を与えるトリフェニルテトラゾリウムクロリウム(TTC)を含む寒天でプレートを重ねます。

コロニー数はサンプルの希釈とともに増加し、抗体濃度が低いほど殺菌活性が低下することを示しています。

まず、サンプルを摂氏56度の温水浴で30分間インキュベートし、試験サンプルを熱不活化します。アッセイプレートと20マイクロリットルのアッセイバッファーをA行からGの列1から12に取得し、20マイクロリットルのアッセイバッファーを行Hの列1と2に追加し、各テストサンプル30マイクロリットルをアッセイプレートのH行に二重にロードします。

試験サンプルの3倍の連続希釈を開始するには、マルチチャンネルピペットを使用して、3Hから12Hのウェルから10マイクロリットルを除去します。サンプルを行Gの対応するウェルに移し、8〜10回上下にピペットでサンプルウェルを混合します。次に、これらのウェルから10マイクロリットルを取り出し、列Fの対応するウェルに移し、ピペットで上下に8〜10回混合します。この連続希釈プロセスを行 A まで続けます。A列のウェルを混合した後、ウェル3Aから12Aまで10マイクロリットルを取り出して廃棄し、すべてのウェルの最終容量が20マイクロリットルになるようにします。

凍結した標的細菌ストックのバイアルを1本取り出し、室温で解凍します。次に、所定の最適希釈係数に従って、細菌を20mlのアッセイバッファーで希釈します。マルチチャンネルピペットを使用して、アッセイプレートの各ウェルに10マイクロリットルの希釈細菌を追加します。

冷凍ウサギの赤ちゃん補体のバイアル1本と冷凍熱不活化BRCのバイアル1本を回収します。冷たい流水を使用してバイアルを室温まで解凍します。次に、100マイクロリットルの熱と熱不活化BRCを400マイクロリットルのアッセイバッファーと混合します。この20%熱不活化BRC溶液を50マイクロリットルを列1のすべてのウェルに加えます。1ミリリットルのネイティブBRCと4ミリリットルのアッセイバッファーを混合します。この20%混合物の50マイクロリットルを、列2から12のすべてのウェルに加えます。プレートをプレートシェーカーに10〜15秒間置き、アッセイプレートを穏やかに混合します。

アッセイプレートを微生物インキュベーターで2時間インキュベートします。その間、2つのLB寒天プレートから蓋を取り外し、プレートを上向きにして生物学的安全キャビネットに40〜60分間置いて乾燥させます。インキュベーションが完了したら、アッセイプレートを湿った氷に移し、10〜20分間インキュベートして反応を停止します。12チャンネルピペットを使用して、H列のウェルを混合し、10マイクロリットルの反応混合物をLBAプレートの底にスポットプレートします。すぐにプレートを傾け、スポットを約1.5〜2センチメートル走らせます。

行 G、F、E に対してこの手順を繰り返し、前の行の上にそれらを見つけます。溶液がLBAプレートに吸収されるまで、LBAプレートを室温でインキュベートします。次に、蓋をプレートに置き、逆さまに微生物インキュベーターに移して一晩インキュベートします。

翌日、100マイクログラム/ミリリットルTTCと0.1%アジ化ナトリウムを含む摂氏55度のオーバーレイ寒天培地25mlを各LBAプレートに加えます。摂氏37度で2時間インキュベートし、生き残った細菌が赤色になるようにします。次に、デジタルカメラを使用してプレートを撮影します。画像をコンピューターに転送し、NISTの統合コロニー列挙ソフトウェアを使用して、テキストプロトコルで概説されているように画像を分析します。