ヒトのインビトロ抑制

この手順の全体的な目的は、in vitro ヒューマンサプレッションアッセイを用いてtreg機能を測定し、将来的な機能喪失を予測することです。まず、細胞刺激剤として使用するコードビーズを調製し、テストすることでこれを達成します。次に、ナイーブCD4陽性CD25陰性T細胞、in vivo 活性化CD4陽性CD25 low T細胞、および制御性CD4陽性CD25 high T細胞を単離し、抗原提示細胞（APC）として使用するための放射線照射PP BMCを準備します。

次に、レスポンダーとしてナイーブT細胞または活性化T細胞を用い、APCとしてP BMCsを用いた単独培養、あるいは同一条件下でtregsを1:10の比率で添加した共培養を行います。最終ステップとして細胞を回収し、トリチウム標識チミジンの取り込みによって増殖能を測定します。最終的に得られた結果から、ナイーブT細胞応答とin vivoで活性化されたT細胞応答における抑制能の差を実証することができます。

ジェフ・ウッドクリフです。制御性T細胞は、固有の細胞表面マーカーを発現していません。したがって、その機能を確実に測定するためには、最高の分離精度を持つ手法を用いて単離する必要があります。

max isolationなどの他の手法と比較して、フローサイトメトリーによる細胞分取（FACS）を用いる主な利点は、非常に純度の高い細胞集団を得られることです。これにより、本手法で示したように、in vitro 抑制アッセイにおいて細胞機能を信頼性高く試験することが可能になります。この手法は、健康な被験者および1型糖尿病に関連する被験者におけるTreg機能への洞察を提供しますが、ヒトの関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症などの他の自己免疫疾患にも適用可能です。抗ヒトCD3でTAAL活性化ビーズをコートします。

元のバイアルからM four 50 toil活性化ビーズを1 mL取り、1.5 mLチューブに入れます。すべてのビーズがチューブの壁面に付着するまで、チューブをマグネットスタンドに設置します。次に、チューブをマグネットスタンドに置いたまま、ピペッティングによりビーズバッファーを除去します。その後、チューブをマグネットスタンドから取り出し、バッファー1を1 mL加えます。

チューブを繰り返しマグネットスタンドに設置します。チューブをマグネットスタンドに置いたまま、バッファーを除去します。ビーズを1 mLのバッファー1で再び再懸濁します。

ここに抗ヒトCD3抗体を40 µL添加します。ビーズと抗体を37 °Cで15分間攪拌します。その後、0.1% w/v BSAを添加し、さらに16時間攪拌を続けます。

次に、ビーズを1 mLのバッファー2中で2〜8°Cで5分間インキュベートし、チューブをマグネットスタンドに置いた状態でバッファーを除去する方法で、ビーズをバッファー2で2回洗浄します。その後、同様の無菌条件下でビーズをさらに1回洗浄します。

今回は1 mLのバッファー3を用い、細胞あたりに添加するCD3コーティングビーズの数を変化させて抗体コーティングの効率をテストし、最適な比率を決定します。96ウェルプレートの各ウェルに50,000個のPBMCを3連（triplicate）で播種します。37 °Cで72時間培養した後、1 µCiのトリチウム標識チミジンを添加し、さらに16時間インキュベートします。マルチスクリーンハーベストプレートまたは同様のプレートを用いて細胞を回収します。

シンチレーション液を加え、ウェルあたりの分当たりカウント数（CPM）を測定します。TopCount® NXTシンチレーションカウンタまたは同等の装置を用い、ビーズと細胞の比率を決定します。当社の経験では、CPMが安定して5,000を超え、かつ15,000未満となる比率が適切です。テストしたすべてのヒト被験者において、通常、細胞1個あたり3個のビーズという比率が、レスポンダー細胞とtreg細胞の両方にとって最適な刺激を与えます。

50 mLコニカルチューブにFicoll-Paqueを15 mL満たします。次に、血液のチューブにPBSを250 mL加えることで、50 mLのバフィーコートを1対6に希釈します。層を乱さないように、希釈したバフィーコート25 mLをFicoll-Paqueの上にゆっくりと重層させます。

4 °Cで800 ×gにて30分間遠心分離します。ブレーキをオフにした状態で、フィコール液と緩衝液の間の白い中間相であるPBMC層を慎重に回収します。必要に応じて、チューブの壁面から細胞を掻き出してください。

数分間待ち、中間相から再度それらを回収します。細胞を新しい50 milliliterチューブに移し、PBSを満たして洗浄し、ペレット化します。PBM cs。

洗浄ステップを毎回2回ずつ繰り返します。2つの細胞ペレットを1本のチューブにまとめ、最終的にすべての細胞ペレットを1本の 50 milliliter チューブにまとめます。その後、懸濁細胞 20 microliters を使用して、トリパンブルー染色法により細胞生存率を測定します。

生存pbmcを1 mL新しいチューブに移し、テスト用のAPCを調製します。次に、4 mLの培地を加え、細胞に5,000 radsを照射します。残りのPBMCが入ったチューブにはPBSバッファーを満たします。その後、細胞を4°Cで10分間、250×gで遠心分離し、上清を捨てて、同じ混合液4 mLで細胞を再懸濁します。

次に、PBMCに200 µLのmax anti CD4 microbeadsを加え、細胞とビーズの混合物を4 °Cで20分間インキュベートします。インキュベーション後、細胞を40 mLのPBSバッファーで洗浄し、細胞をペレット化します。その後、上清を捨て、室温で8 mLの脱気PBSバッファーに細胞を再懸濁します。

次に、分画フィルターを使用して細胞懸濁液を分離ろ過します。その後、PBM CSを2本の15 milliliterチューブに分け、各チューブにP BMCsを4 millilitersずつ加えます。

2本のカラムをミニマックスセパレーターに固定し、各カラムの下に回収チューブを配置します。次に、各カラムに3 mLのDGAs PBSバッファーを加えます。バッファーがなくなったら、細胞懸濁液が完全に流れ切る前に、各チューブから4 mLの細胞溶液全体をカラムに重層します。さらに、室温のDGAs PBSバッファー3 mLを各カラムに加え、回収チューブへ流し込みます。

透明な液体が出てくるまで、さらにバッファーを加えます。DGAsバッファーをLSカラムにさらに5 mLピペッティングし、その後、minimaxセパレーターからLSカラムを取り出します。カラムを新しい滅菌済みの50 mL回収チューブに移します。

0.5 mLを流し出した後、残りの約4 mLの容量をゆっくりとプランジャーで押し出します。次に、CD4陽性の2つの画分を合わせます。その後、チューブに最大50 mLのPBSを加え、4 °Cで10分間、400 ×gで遠心分離した後に細胞数をカウントします。

細胞を2 mLのPBSバッファーで再懸濁します。表面染色に使用する抗体（anti CD 14、CD 32、CD 16、および必要に応じてanti CD 4）を1本のチューブにまとめます。この混合液の一部を分注し、FLUOROCHROMEマイナスチューブの染色に使用します。

チューブ内の細胞懸濁液から5 µLを FACSチューブに移してFMOチューブを調製し、あらかじめ調製した抗体カクテル2 µLで細胞を染色します。次に、セルソーティング用のコンペンセーションコントロールとして使用するため、未染色細胞およびマウスIgGコートビーズをそれぞれ新しい個別のFACSチューブに入れ、単一の蛍光色素で染色します。その後、抗ヒトCD25 PEを50 µLカクテルに加え、そのカクテルを残りの細胞懸濁液に加えます。

チューブを4 °Cで30分間インキュベートします。抗体カクテルで細胞をインキュベートした後、細胞にPBSバッファーを加え、遠心してペレット化します。ペレットをPBSバッファーに懸濁し、濃度を10⁷ cells/mLに調整します。

FMOチューブを使用して、CD 25陽性T細胞のソーティングのための閾値を設定します。このゲーティング戦略を用いて、まず、この図に示されているように、単球、マクロファージ、およびその他のすべてのCD four陽性非T細胞で構成されるfitz陽性細胞を除外するために、fite陰性細胞の周囲にゲートを設定します。別のプロットで、この図のように、CD 25陰性およびCD 25 low T細胞、およびCD 25 high treg細胞のゲートを描画します。

フローサイトメトリーによる細胞サブセットの分取後、回収チューブを遠心してペレット化し、播種までT細胞を氷上に保持する。表に示す通りにU底96ウェルプレートにラベルを貼る。1ウェルあたりレスポンダー細胞1個に対しCD3コートビーズ3個の濃度になるよう計算したCD3コートビーズの50 µL分注量を、10%プールヒトAB血清を含む完全培地で96ウェルプレートに懸濁させ、次いで、あらかじめ照射したAPCを培地で5 × 10⁵ cells/mLの濃度に希釈する。

細胞 50 µLを96ウェルプレートに加え、次に2.5 × 10⁴個のCD4陽性CD25陰性またはCD4陽性CD25低発現T細胞を1ウェルあたり3連（triplicate）で加えます。ここに示すように、行Bおよび「tregs only」とラベル付けされたウェルに、共培養の1:10の比率でTregを加えます。その後、プレートを37 °C、5% CO2、飽和湿度のインキュベーター内で72時間培養します。次に、1 µCiのトリチウム標識チミジンで細胞をパルス標識し、共培養の最後の数時間にチミジンが取り込まれた後、さらに37 °Cで16時間培養を継続します。

フィルターメイトハーベスターを使用して、マルチスクリーン収穫プレート上の細胞を回収します。次に、あらかじめシンチレーション液を満たしておいた透明プラスチックカバーで収穫プレートを覆います。最後に、ウェルあたりのCPMを測定します。

シンチレーションカウンターを用いることで、本システムによりT細胞サブセットを高純度に単離することが可能です。以下のドットプロットの一連の図に示すように、下方のゲートにCD4陽性CD25陰性T細胞が示されています。次の図では、高度に精製されたCD4陽性CD25低発現T細胞が確認できます。これはフローソートされた純粋なCD4陽性細胞集団です。

上部のゲートコントロールにCD 25高発現treg細胞が示されています。健常被験者由来のAPCおよびtregの単一細胞種培養では、チミジン取り込み法による測定でバックグラウンド以上の増殖はほとんど認められませんでしたが、ナイーブCD 25陰性T細胞およびin vivo活性化CD 25低発現T細胞は著しい増殖を示し、これらのレスポンダー細胞をtreg細胞と共培養するとその増殖が抑制されました。なお、レスポンダーであるナイーブCD 25陰性T細胞およびin vivo活性化CD 25低発現T細胞に対するtregの抑制能には、わずかな差が観察されました。

対照群において有意差は認められませんでした。リスク群被験者由来のAPCおよびTregの単一細胞タイプ培養では、チミジン取り込み法で測定したところ、バックグラウンドに対して増殖はほとんど、あるいは全く認められませんでした。一方で、ナイーブCD25陰性およびInVivo活性化CD25低発現T細胞は、健康対照群と比較して増殖レベルが低いことが示されました。

このアッセイは信頼性の高い結果をもたらすため、レスポンダーT細胞はtregおよび共培養によってさらに抑制されました。加えて、低いCPM値はシグナル伝達における潜在的な欠陥を示唆しており、これは別の種類の研究でさらに調査されるべきであると結論付けることができます。しかしながら、リスク群の被験者において、CD 25陰性のレスポンダーT細胞に対するtregの抑制能と、CD 25低発現のレスポンダーT細胞に対する抑制能との間には、有意な差が認められました。

このビデオを視聴することで、健康な被験者および、1型糖尿病患者などの免疫系が損なわれた被験者におけるTregsの存在を確認するための、正確で信頼性の高い機能試験に必要なすべての手順を、どのように円滑に連携させて進めるべきかを十分に理解できるはずです。