相間細胞核の力学特性を探査する生物物理学的なアッセイ：基板の歪みのアプリケーションおよびマイクロニードル操作

以下の一連の実験の全体的な目的は、細胞核の界面における機械的特性と、周囲の細胞骨格との物理的な結合を測定することです。これは、透明なシリコン膜上に播種した細胞に機械的歪みを加え、それによって誘起される核の変形をイメージングすることで達成されます。核の変形が増大することは、核の剛性の低下に対応しますが、核と細胞骨格のカップリングの変化もまた、誘起される核の変形に影響を及ぼす可能性があります。

細胞骨格に局所的な歪みを加えることで、細胞骨格と核の間の細胞内力伝達を直接的に調査します。次に、蛍光標識した核および細胞骨格構造の変位をイメージングします。これにより、周囲の細胞骨格に対する細胞核の剛性を示す結果が得られます。

基質歪み実験に基づくと、マイクロニードル操作アッセイにより、核と細胞骨格のカップリングの破壊が細胞内での力伝達の欠損を引き起こすことが明らかになります。単離した核のマイクロピペット吸引などの既存の手法に対するこれらの技術の主な利点は、正常な細胞構造を乱すことなく、生存している完全な細胞における核の力学特性を測定できる点にあります。これらの手法は、核膜組成の変化が核の機械的特性にどのように影響を与えるかについての知見を提供することができます。

また、これらは LA ニューロパチーや癌などの疾患における核力学の役割を研究するためにも応用可能です。各ストレインディッシュは、直径 3 インチのカスタムメイドの底なしプラスチックディッシュと、細胞培養基質となるシリコンメンブレンを固定するためのプラスチック製 O リングで構成されています。ストレインディッシュを準備するには、4 インチ四方のシリコンメンブレンを O リングとディッシュの間に挟み込み、余分なメンブレンを慎重に切り取り、ストレインディッシュを脱イオン水で洗浄し、オートクレーブ滅菌します。その後、シリコンメンブレンを細胞外マトリックス分子でコーティングし、メンブレン底面中央の外側に基準点をマークします。

このランドマークは、一軸方向への歪み適用を行う歪み実験において、同一の細胞を特定するのに役立ちます。基準点の周囲にスコッチテープを2本の平行なストライプ状に貼り、膜の形成を一次元に制限します。最適な細胞接着を実現するため、シリコン膜を 3 µg/mL のフィブロネクチンまたは適切な細胞外マトリックスタンパク質でコーティングします。

ストレインディッシュを、逆さまにした10 centimeterのポリスチレン製ディッシュで覆い、4 °Cで一晩インキュベートします。翌日、メンブレンをPBSで1回すすぎ、余剰なタンパク質を除去します。ディッシュに10 millilitersの増殖培地を満たし、そのままにしておきます。

コーティング済みシリコンメンブレンディッシュの準備が完了したら、0.05% trypsinを用いて細胞を剥離し、成長培地を用いて接着細胞をディッシュ上に播種します。この手順はマウス胚細胞を用いて実演します。

線維芽細胞またはmesを用いて、通常の培養条件下で細胞を24から48時間インキュベートします。基質歪み実験用に装備された倒立顕微鏡には、顕微鏡ステージに適合するベースプレートで構成される歪み付加装置が含まれています。このプレートは中央の円筒形プラチンを保持しており、これがシリコンメンブレンの中央部分に歪みを加える役割を果たします。

この装置には、ストレインディッシュを保持し、4本のガイドピンに沿って上下にスライドさせることができる可動プレートと、荷重をかけるための5ポンドの重りが備わっています。核を可視化するためには、ストレインディッシュ内の細胞を1 µg/mLのHoechst染料とともに37 °Cで15分間インキュベートします。インキュベーション後、培地を吸引して除去し、25 mM HEPESを含むフェノールレッドフリーの増殖培地15 mLに交換します。

次に、ディッシュをディッシュホルダーにねじ込み、シリコンメンブレンが中央のプラチナ上でスムーズに滑るように、メンブレン底面の周囲に慎重にグリースを塗布します。このとき、メンブレンの中央部分は汚さないようにしてください。ベースプレートを顕微鏡のステージプレートの上に置き、ベースプレートにディッシュホルダーを慎重に取り付けます。

初期の静止状態で、ストレインディッシュのシリコン膜が中央のプラティンの上に軽く乗っていることを確認します。次に、シリコン膜の底部に焦点を合わせ、中央にある黒色のリファレンスドットを探します。このドットはすべての画像取得の起点となり、ストレッチ中およびストレッチ後に同一の細胞を特定するのに役立ちます。

この画像では、中央のドットが視野全体を占めています。ドットの境界から始めてフォーカスを調整し、細胞とシリコンメンブレンの上端を可視化させてください。核が中央に位置し、十分に広がった細胞を探します。

細胞の輪郭とシリコンメンブレンに焦点を合わせて、位相差像を取得します。次に、核の中央平面に焦点を合わせて、核フック染色の蛍光像を取得します。5〜15個の細胞の画像を取得した後、中央のドットまで戻ります。

荷重をゆっくりとストレインディッシュにかけ、均一にストレインを適用します。ディッシュの中心に適用します。基材に適用される最大ストレインは、垂直アライメントピンに配置されたナイロンスペーサーによって制限されます。ストレイン適用後、シリコンメンブレンの底部にフォーカスを合わせ、リファレンスドットを再度特定し、そのドットから開始します。

同じ細胞に再び移動し、フルストレイン（最大歪み）状態にある各細胞の核の位相差画像および蛍光画像を、初期画像の焦点面とできるだけ一致させるように取得します。細胞が不慣れな基質に対して能動的なリモデリングや適応を起こさないよう、この工程は10分以内に完了させる必要があります。すべての対応する画像の取得が完了したら、顕微鏡ステージを開始位置に戻します。

ディッシュホルダープレートからウェイトを慎重に取り除き、必要に応じてシリコンメンブレンを弛緩させます。ストレインディッシュを、初期位置に戻るまでゆっくりと押し上げます。その後、位相差および蛍光像を取得します。

ストレイン後細胞の画像（ストレイン画像の記述と同様）および、ストレイン印加前、印加中、印加後の細胞と蛍光標識された核の画像を解析し、正規化核ストレインを算出します。本デモンストレーションでは、解析にカスタム作成したMATLABスクリプトを使用していますが、代替案として、印加された基板ストレインを手動で計算し、対応するストレイン前およびストレイン後の画像間で、膜上に位置する3〜6箇所のコントロールポイントの位置を照合する方法もあります。その後、MATLABプログラムが、ストレイン前とフルストレイン画像の間で一致するコントロールポイントの位置を比較することにより、印加された膜ストレインを算出します。

また、歪み付加前後の画像における残留歪みの位置についても比較を行います。コントロールポイントを使用して画像ペアのレジストレーションを同時に行うことで、損傷または剥離した細胞の検出が可能になります。次に、個々の核の核歪みを算出する別のMATLABプログラムを用いて、核を手動で選択します。

これは、歪み印加前後の対応する蛍光画像間で核のサイズを合わせるか、あるいは核内マーカーを合わせることで、異なる実験間における印加膜歪みのわずかな変動を補正することによって達成されます。結果は正規化核歪みとして表されます。これは、各核について算出された、誘発された核歪みの印加膜歪みに対する比として定義されます。

MATLABスクリプトは、要求に応じてlambing研究室から提供されます。最終ステップとして、各核を検証し、歪みの印加中に脱落または損傷した細胞からの測定値は除外します。シリコンメンブレン上の2つの異なる領域に広がったMEFを、20%の単軸歪みの印加前、印加中、および印加後に位相差顕微鏡および蛍光顕微鏡で撮影しました。ここに、歪みの印加を受けても損傷や脱落することなく生存した細胞から得られた、有効な核を持つ成功した実験例を示します。

対照的に、ここに示されている細胞は、歪みの印加中に収縮または部分的に剥離したため、解析から除外されています。左側の細胞は細胞骨格の損傷と核の崩壊の兆候が見られ、右側の細胞は歪みの印加中に部分的に剥離し、収縮しています。これは過度な歪みがかかったことを示唆しています。

ここでは、Lamin AC欠損マウスのさまざまなmeth細胞株パネルにおける標準化された核歪みの解析結果を示します。これらの細胞は、野生型リターメイト由来のmethと比較して、空ベクトルまたは野生型lamin Aを異所的に発現させています。核膜タンパク質であるLamin ACの発現喪失は、標準化された核歪みの増加をもたらします。これは核剛性の低下を示しており、野生型Lamin Aを再導入することで部分的または完全に回復させることができます。マイクロニードル操作実験の準備として、35 mmのガラスボトム細胞培養ディッシュを低濃度のフィブロネクチンで37 °Cで2時間インキュベートします。インキュベーション後、ディッシュをHBSSで2回洗浄し、2 mLの増殖培地をディッシュに加えます。

次に、マウス胚性線維芽細胞を0.05%trypsinでトリプシン処理し、2mLの増殖培地と共にフィブロネクチンコート済みガラスボトムディッシュに播種します。単層の接着性非コンフルエント細胞を得るため、細胞をインキュベーターに戻して一晩培養します。細胞を染色するために、MitoTrackerミトコンドリア染色剤とHoechst核染色剤を増殖培地に添加します。この増殖培地を細胞に加え、その後インキュベートします。

次に、細胞をハンクス平衡塩溶液で室温にて5分間インキュベートし、洗浄します。その後、25 mMの HEPES を含むフェノールレッドフリーの増殖培地を細胞に加え、イメージングを行います。

マイクロニードル実験では、あらかじめ作製したマイクロニードルを、デジタル電荷結合素子（CCD）カメラ付き倒立顕微鏡に接続されたマイクロマニピュレーターに装着します。カメラを用いて、マイクロニードルを単一細胞の近傍にフォーカスさせます。マイクロニードルを細胞骨格に挿入する前の、単一細胞の画像を1枚取得します。

位相差顕微鏡にて、フック 3 3, 3 4 2 染色およびミトコンドリア染色の蛍光画像を、倒立顕微鏡の 60 x 対物レンズを用いてそれぞれ1枚ずつ撮影します。マイクロマニピュレーターを用いて、核周辺から一定の距離にある細胞の細胞質にマイクロニードルを慎重に挿入し、位相差画像1枚、フック 3 3, 3 4, 2 染色の蛍光画像1枚、およびミトコンドリア染色の蛍光画像1枚を撮影します。コンピュータ制御のマイクロマニピュレーターを使用し、1 µm/s の速度でマイクロニードルを細胞辺縁方向へ特定の距離まで移動させながら、10秒ごとに自動的に画像をキャプチャします。

マイクロニードルを細胞辺縁に向かって特定の距離まで移動させる際、一貫したマイクロマニピュレーションを実現するために、マイクロマニピュレーターをコンピュータで制御する必要があります。最終的な手順として、マイクロニードルを除去した後に画像を撮影します。マイクロニードル操作の前、最中、および後に取得した、蛍光標識された核および細胞骨格の特徴的な画像から、細胞内の小さな領域の変位を算出するために解析を行います。本デモンストレーションでは、解析にカスタム作成したMATLABスクリプトを使用していますが、他にもいくつかの選択肢があります。

マイクロニードルによって生じた変位を測定するためのMATLABスクリプトは、Lambing研究室に請求することで入手可能です。このMATLABプログラムは、正規化相互相関アルゴリズムを用いて、蛍光ラベル化された特徴点の元の位置と新たに特定された位置との間のシフトを算出します。その後、変位はベクトルマップとして表示され、数値として保存されます。

次のステップでは、得られた変位ベクトルマップを用いて、Matlabで細胞骨格または核内の平均変位を決定します。まず、歪みの印加部位における細胞骨格内の3点以上の点を選択してください。変位ベクトルマップにおいて数値の平均値を算出することで、マイクロニードルの印加中に印加部位付近で発生した細胞骨格の歪み量を決定します。

次に、歪み負荷部位に近い核内の3点以上を選択し、その平均値を算出します。この値は、マイクロニードル負荷部位付近の核歪みの量を表します。同様の方法で、それぞれの領域から選択した点を用いて、歪み負荷部位から離れた場所の核および細胞骨格の歪みを決定します。

細胞内での力伝達を測定するために、マイクロニードル操作アッセイを実施した。ここでは、青色の核染色とMIT tracker greenミトコンドリア染色で標識した線維芽細胞の位相差像および蛍光像を示す。マイクロニードルを核から一定の距離にある細胞骨格に挿入し、その後、細胞外周に向かって移動させた。

細胞骨格への負荷前、負荷中、および負荷後のミトコンドリアの変位を追跡し、その変位をベクトルとしてプロットした。各ベクトルは、元の位置と新たに特定された位置との間のずれとして算出された変位を表している。画像強度が低い領域やテクスチャが不十分な領域は、解析から除外した。

その後、対照群の線維芽細胞と線維芽細胞の両方において、歪みの負荷部位から距離を離した特定の領域での細胞骨格および核の変位を定量化した。核・細胞骨格の結合が維持されている細胞では、力は細胞全体に伝達されるため、負荷部位から離れるにつれて緩やかに減衰する核および細胞骨格の変形が誘導される。対照的に、核・細胞骨格の結合が損なわれた細胞では、負荷部位付近で局所的な変位が見られ、それより離れた部位では誘導される変形はわずかである。

コントロールの線維芽細胞と、核・細胞骨格カップリングを破壊した線維芽細胞の両方において、マイクロニードル挿入部位では同等の細胞骨格歪みの印加が観察されました。しかしながら、その他の領域における誘発的な核および細胞骨格の変位は、コントロール細胞と比較して、核・細胞骨格カップリングを破壊した線維芽細胞では有意に小さい結果となりました。したがって、歪み印加部位から離れた場所での細胞骨格および核の変位の減少は、細胞骨格と核の間の強制伝達が妨げられたことを示しています。

このビデオを視聴することで、核の力学および核と細胞骨格間の細胞内力伝達の測定方法について十分に理解することができます。これらの手法を用いて、核膜タンパク質の変異の影響や、発生過程または癌において生じる核膜組成の変化について研究することが可能です。