マイクロタイタープレート形式で液体希釈法により、第一、第二ラインの薬のための結核菌の複合体の抗菌薬感受性試験

結核菌（Mycobacterium tuberculosis）の治療に利用可能な薬剤は比較的少なく、あらゆる薬剤への耐性獲得が懸念されています。本ビデオ論文では、M tuberculosisの12種類の異なる抗菌薬に対する耐性を同時に検査する手順について解説します。したがって、M tuberculosisの薬剤耐性を迅速に検出する能力は、耐性株の増加を抑制する取り組みにおいて非常に重要です。ここでは、抗菌薬感受性を試験する方法について述べます。

M tuberculosisをまず固体培地または液体培地で培養し、細菌懸濁液を作成します。接種量を調製し、一次薬剤および二次薬剤を含む12種類の薬剤を異なる濃度で分注したマイクロタイタープレートに添加します。インキュベーション後、各ウェルの増殖程度をミラーボックスを用いて手動で、または半自動プレートリーダーを用いて判定します。

得られたデータは、テストした各薬剤の最小発育阻止濃度を示し、テストした結核菌株がどの抗菌薬に耐性を持っているかを示します。これらの結果は、結核治療に適した薬剤を選択するのに役立ちます。こんにちは、私はナンシー・エックです。ミネソタ州ロチェスターのメイヨー・クリニックにあるマイコバクテリオロジー研究室のディレクターを務めています。

本日は、結核菌（mycobacterium tuberculosis）の薬剤感受性試験の方法について説明します。マクロブロス希釈法などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、各薬剤のMIC（最小発育阻止濃度）を決定でき、かつ12種類の抗菌薬を同時に試験できる点にあります。実際の操作手順については、当研究室の品質管理スペシャリストであるKurt Judeが、実験ベンチにて実演します。

血液寒天地培地、Middlebrooks 7H10培地3枚、生理食塩Tweenガラスビーズ管、およびマイクロタイタープレートに、患者名と検体識別番号を記入して準備します。さらに、血液寒天培地と7H10培地に「純度確認用」とラベルを貼ります。これらの7H10培地のうち1枚に「1:1コロニー数」、もう1枚に「1:50コロニー数」と記入してください。

次に、トレイをパスボックスに入れます。続いて、前方閉鎖型ガウン、ヘッドカバー、手袋、シューズカバー、および呼吸用保護具を着用し、バイオセーフティレベル3（BSL 3）施設での作業準備を整えます。ここでは、PAPR（電動ファン付き呼吸用保護具）を使用します。

次に、パススルーからトレイを回収します。続いて、BSL3施設内で、生物安全キャビネットの表面を消毒します。その後、消毒液に浸したペーパータオルをフード内に置き、ペーパータオルの隣にあるエアベントパネルから約6インチ離した位置に配置します。

接種ループ、ピペッターとチップ、適切な廃棄物容器、nephi、TER、およびボルテックスを用意します。フードの準備が整ったら、OADCを含む seven H nine broth と生理食塩水ビーズチューブを入れたラックと共に、微生物をペーパータオルの上に配置します。このセットアップは固体培地から行います。

患者検体の固体培地培養物から接種源を調製します。滅菌ループを用いてコロニーを掻き取り、サリンTweenガラスビーズチューブに移します。懸濁液を30〜60秒間ボルテックスします。

サンプルを目視で確認し、マクファランド標準液と比較します。分注した量は標準液と同等か、それ以上である必要があります。そうでない場合は、細菌サンプルを追加し、再度ボルテックスミキサーで撹拌してください。

マクファーランド標準液と一致させた後、細菌の大きな凝集塊を沈殿させるため、接種液を15分間静置します。次に、nefi TERを用いて懸濁した細菌の密度を測定し、ゼロ点調整を行います。nephi ter。

まず、生理食塩水ビーズが入った空のチューブをネフェロメーターにセットします。キャリブレーションボタンを押して計器をゼロ点調整し、次にMcFarland 0.5標準液をネフェロメーターにセットして、再度キャリブレーションボタンを押します。計器の校正が完了したら、McFarland標準液を取り出し、接種液を挿入します。

接種菌液の測定値は、マクファーランド標準液の測定値と一致させる必要があります。測定値が低すぎる場合は、チューブを取り出し、プレートからさらに細菌を移してください。その後、ボルテックスで攪拌し、サンプルを再度測定します。

読み取り値が高すぎる場合は、チューブにサリネTweenを加えてボルテックスします。その後、サンプルを再度測定してください。細菌の濃度がマクファーランド標準液と一致するまで、必要に応じて接種量を調整し続けます。

次に、200 µLピペッターとフィルター付きロングピペットチップを使用して、チューブの上部3分の1から100 µLの接種液を採取します。Middlebrook 7H9ブイヨンに沈殿した凝集塊を避けるため、接種済みのブイヨンを20秒間ゆっくりとボルテックスして接種液を均一にします。まず、メーカーのパッケージからマイクロタイタープレートを取り出します。乾燥剤が青色であるか、またはアルミ箔パッケージが破損している場合は、使用しないでください。

プレートの各ウェルには、最も効果的な第一選択薬および第二選択薬を含む、テスト対象の12種類の抗菌剤がすでに分注されています。エアロゾルが発生しないよう注意しながら、7 H9ブロス接種液をチューブに慎重に注ぎます。次に、図のようにラベルを外側に向けてマイクロタイタープレートを設置し、12チャンネルピペッターを使用して、各ウェルに接種液を100 µLずつ加えます。

次に、コロニー計数を行うためのプレートを準備します。まず、陽性対照ウェルからサンプルを1 µLループで採取し、「1 to 1」と表記された7 H 10プレートに移して、未希釈プレートを作成します。その後、ループを用いて、ここに示すようにプレートに画線塗布を行います。

次に、1/50希釈液を調製するため、陽性コントロールウェルから1 µLループで分取し、50 µLの滅菌水が入ったチューブに入れて撹拌します。この希釈液1 µLを、「1 to 50」と表記したプレートに塗抹します。純度確認用プレートへの接種は、tryptic soy brothから接種液50 µLを適切にラベル付けした血液寒天培地および7 H 10培地にピペッティングし、単離 streaking を行います。

次に、接種済みのtrthの上に別のtrthを重ね、慎重に廃棄容器に入れます。マイクロタイタープレートに粘着シールを貼ります。その後、白いバッキングを用いて各ウェルをしっかりと押し付け、シワが入らないようにして適切に密閉します。

結核菌用消毒剤を浸したペーパータオルでマイクロタイタープレートを拭き、消毒します。次に、マイクロタイタープレートをプラスチック袋に入れ、ヒートシールで密閉します。最後に、ピペット、ボルテックスミキサー、プレート、チューブを含むすべての器具を、結核菌用消毒剤で拭いて消毒します。

ここでは、消毒を確実にするために十分な時間を経過させた後、pro sprayを使用します。pro sprayの処理時間は15分間です。プレートをスコッチテープで固定してプラスチック袋に入れ、密封した用品をバイオセーフティキャビネットから取り出してパススルーボックスに移動させます。

廃棄用の赤色バッグを閉じ、ツイストタイで封印します。この時点で、ガウン、ブーツカバー、および手袋を脱ぎます。前室へ移動して手を洗い、その後、レスピレーターを外します。再度手を洗った後、レスピレーターを消毒して保管し、新しいガウンを着用してBSL-3施設から退出します。次に、廃棄容器をオートクレーブで滅菌します。

続いて、マイクロタイタープレートと7枚のH 10および血液寒天プレートを、BSL 2ラボ内の35～37 °C、5～10% CO2のインキュベーターで、正立状態で培養します。プレートは密閉され、プラスチック袋に入っているため、この方法は許容されます。Mycobacterium tuberculosisの世代時間は約12～24時間であるため、コントロールウェルの底部に細胞ペレットが形成され、増殖が確認できるまでには少なくとも1週間かかります。10日目に、密閉したASTマイクロタイタープレートをミラーボックスのプラットフォームに設置し、手動でミラー読み取りを行います。

デスクランプを使用して増殖の視認を補助し、最適なコントラストが得られるように適宜調整します。この例では、ミラーで確認し、増殖コントロールウェル（H 11およびH 12）をチェックします。増殖がある場合、ここに示すように、ウェルが濁っていたり、沈殿物があるように見えたりします。

この例のように増殖が見られない場合、ウェルは透明に見えます。この場合は、プレートをインキュベーターに戻し、最大21日間まで培養を継続してください。各条件について、コントロールと増殖を比較します。

次に、各薬剤の記録について、増殖が見られない最初の希釈段階を確認します。これが、その薬剤の最小発育阻止濃度（MIC）となります。自動プレートリーダー（Visonなど）を使用して結果を確認するには、まずMycoTB ASTプレートソフトウェアを開いてログインします。バーコードを外側に向けて、密封されたプレートをセットしてください。ここでは、増殖が濁度として、あるいはウェルの底に細胞が沈殿している状態でコンピュータ画面に表示されます。

まず、増殖コントロールを確認します。前述の手順と同様です。増殖が陰性である場合は、プレートを最大21日間インキュベーターに戻してください。

陽性である場合は、各薬剤について、増殖が見られない最初のウェルを画面上でタッチして結果を記録します。場合によっては、細菌、沈殿物、または薬剤がウェルの底に沈殿することがあります。この現象は「トレーリング（trailing）」として知られており、同じサイズのペレットが複数のウェルに認められることで示されますが、実際には陽性の増殖とはみなされません。

次に、7枚のH 10培地と血液寒天培地を検査し、細菌濃度を決定して純度を評価します。血液寒天培地では、48時間後に増殖が見られないはずです。血液寒天培地で増殖が認められた場合は、急速に増殖する細菌による汚染を示しています。

菌の増殖が認められる場合は、マイクロタイター試験を繰り返す必要があります。7 H 10 純粋培養プレートでは、1種類の菌のみが増殖している必要があります。Type EM tuberculosisは、淡黄色で、しわ状で、粗い外観を呈します。コンタミネーションが認められた場合は、純粋培養からマイクロタイター試験をやり直す必要があります。

細菌濃度を評価するために、7枚のH 10プレート上のコロニー数を数えます。次に、付属の書面にある表を用いて、コロニー数を算出してください。患者検体からMycobacterium tuberculosisを培養し、本ビデオで説明した方法で抗生物質耐性を評価しました。ここに示すプレートには、12種類の異なる薬剤が濃度勾配で配置されており、上部が最高濃度、下部が最低濃度となっています。

薬剤の最小発育阻止濃度（MIC）は、増殖が認められない最低薬剤濃度によって示され、ここに示す画像ではClinical and Laboratory Standards Instituteによって設定された標準的なブレークポイントを用いて円で囲まれています。ここに示されたデータは、この結核菌株がIsidおよびRifampinに耐性を持つことを示唆しています。in vitroにおいて、oin、moxifloxacin、streptomycin、およびrifabutinを含む他のいくつかの薬剤で認められた高いMICは、このEM結核菌株がこれらの薬剤に対して耐性を持つことを示唆しています。

MICの結果は、結核治療に精通した感染症専門医が個別の治療計画を策定するために使用する必要があります。この手法に習熟すれば、1つの分離株のセットアップに約40分かかります。この手順を行う際は、本菌が呼吸器系病原体であり、エアロゾルが発生し得ることに留意することが重要です。このビデオを視聴することで、微量液体希釈法を用いたMycobacterium tuberculosisの薬剤感受性試験のセットアップ方法について十分に理解できたはずです。Mycobacterium tuberculosisを扱うことは非常に危険であるため、必要に応じて呼吸器保護などの予防措置を常に講じてください。