ストレッチ誘発性心房細動の羊のモデルで高解像度の心内膜と心外膜光学マッピング

このプロトコルでは、高空間・時間分解能の光学マッピングを用いて、ストレッチ誘発性心房細動の根底にあるメカニズムを解明します。まず羊の心臓を摘出し、大動脈を介して酸素供給されたタイロー液を循環させるLAN endorf灌流システムに接続することで、これを実現します。心房中隔穿刺を行い、下大静脈を除くすべての静脈口を封鎖し、下大静脈を用いて心房内圧を制御します。

次に、持続的な心房伸展下で、左心耳の頂点に配置した電極からのバーストペースを用いて持続性心房細動を誘発します。最終ステップとして、レーザー照明CCDカメラと双極電極を用いて、左心耳および左心房後壁の外膜面と内膜面を光学的および電気的にマッピングします。その結果、左心房後壁から左心耳および右心房にかけて、ドミナント周波数の勾配が認められました。

さらに、最高周波数領域に回転中心を持つ、時折出現する持続性の長いローターが同定されます。従来のヒト電生理学的研究で一般的に用いられている従来の電気的マッピングなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、左心房の心外膜および心内膜の光学マッピングにより、広範囲にわたって高い時間・空間分解能が得られることです。これにより、心房細動を維持させる高周波ローター領域を含む、さまざまな領域における心房細動波の追跡が可能になります。この手法は、臨床現場で最も一般的な持続性不整脈の維持の根底にある、特殊な時間的活性化パターンとはどのようなものであるかといった、心臓電生理学および複雑な心不整脈分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。

この手法を用いることの意義は、心房細動のメカニズムをより深く理解することに基づき、その予防または停止に向けた治療の可能性へと広がります。一般的に、この手法に慣れていない人は、すべての工程を適切な時間内にスムーズに遂行することに苦労します。なお、単離にかけられる時間は4時間程度と限られていることに注意してください。

心臓を不整脈のオプティカルマッピングに適した条件で維持します。これには、心房ストレッチモデルを適切に構築するための外科的技術と、電気的および光学的マッピングシステムを構築するための技術的なスキルの両方が必要です。35から40 kgの羊にヘパリンを投与し、プロポフォールとペントバルビタールで麻酔をかけた後、開胸術を用いて心臓を摘出します。

摘出した心臓を、pH 7.4の酸素飽和タイロ溶液を循環させるLAN灌流システムに接続し、一定流量を240から270 milliliters per minuteに設定し、温度を35.5から37.5 degrees Celsiusに維持します。まず、灌流した心臓の両心房内の心腔内圧を等しくします。心房中隔穿刺を用いて、下大静脈に流出チューブをカニューレ挿入します。

次に、心房の上に配置した開放末端の流出カニューレの高さを変更して、心房内圧を調整します。ここで、冠状静脈洞、上大静脈、および4本の肺静脈を含むすべての静脈開口部を封鎖します。肺静脈を封鎖する際は、それぞれの肺静脈にカテーテルを挿入し、差動増幅器を介して2つの遠位電極からのバイポーラ信号を記録します。

次に、心筋細胞の収縮能による組織の動きを抑制するため、灌流液に10 µMのBLEs statinを添加します。カニューレ基部のデジタルセンサーを用いて圧力を監視してください。実験全体を通して12 cmH₂Oの安定した圧力を維持するように、流出部の高さを継続的に調整します。

最後に、バイポーラ電極を左心耳の屋根部分および右心耳の上部に配置します。次に、光学マッピングの準備を行います。まず、高解像度高速CCDカメラの焦点を、左心房遊離壁表面の約14 square centimetersに合わせます。

次に、レーザー光源を配置して当該領域を照射します。続いて、直径10 mmのデュアルチャンネル硬性ボアスコープを僧帽弁を介して挿入し、左室前壁を通して直接的な視野を確保します。ボアスコープの焦点を左心房後壁の内膜表面に合わせ、4本の肺静脈と心房中隔肺束を可視化します。

次に、コア径0.2 inchの液体ライトガイドを用い、接眼レンズアダプターを介してボアスコープを2台目のCCDカメラに取り付けます。ボアスコープの励起チャンネルにレーザーを設置します。両方のCCDカメラの記録を同期させ、同時にバイポーラ記録をトリガーするための正方形TTLパルスを出力するように設定します。

光学記録の準備として、5〜10 mLのdi-4-ANEPを心臓に注入し、光学マッピング記録を開始する前に10分間待機します。di-4-ANEP PSは、532 nmのレーザー励起によって電圧感受性蛍光を放出します。したがって、添加後すぐに心房細動の記録に進みます。持続的な心房伸展下で心房細動を誘発するため、心房細動中のバーストペースメーカー用に電極を左心耳（LAA）の上に設置します。

2台のカメラから、2分間隔で5秒間の動画を同時に記録します。心房細動の記録を50分間継続し、収集した生データに対して、双極性信号に3 Hzの高域通過フィルタと35 Hzの低域通過フィルタを適用します。次に、電気信号と光学信号の両方を解析するため、FFTアルゴリズムを用いて両者を変換します。

最後に、活性化率の高い領域を特定し、周波数勾配を作成するために、ヒルベルト変換を用いて生成した位相ムービーから各光学ムービーの支配周波数マップを作成します。これにより、3つのクラスの活性化パターンを識別できます。ローターパターンは、1回転以上の時間をかけて特異点に向かって収束する位相の存在によって識別されます。ブレイクスルーパターンは、視野内に現れ、標的のようなパターンで外側に向かって伝播する波面として定義されます。

時空間的に組織化された周期的波は、同一の場所から同様の方向および波間隔で発生する、最低4回の連続的な周期的波と定義されます。この代表的な心房細動エピソードにおいて、最高の主周波数は左心房後壁の右下肺静脈に局在していました。PLAにおける高周波源の存在は、近位心房細動のアブレーション手技中に観察される、左から右への主周波数勾配と一致しています。

さらなる定量化により、最も支配的な周波数が高い領域と、最も一般的な活性化パターンの空間的な相関を明らかにすることができます。場合によっては、最高周波数領域内に局在する持続的なローターを特定することが可能です。また、スクロール波の回転中心がマッピング領域の表面に対して垂直に維持されるため、ローターの3次元相当であるスクロール波が特定されることがあります。

このローターは、LAAに向かう同時繊維伝導を伴い、PLAの内膜から記録されました。このデータは、PLAとLAAの間でそれぞれ9 Hzおよび6.4 Hzの周波数勾配があることと相関しています。一般に、ローターはLAAよりもPLAにおいてより頻繁に観察され、PLAへのリエントリーが不整脈の維持に重要な役割を果たしていることが示唆されます。

外科的および技術的な手法を習得すれば、この実験は2〜3時間で完了できます。実験を成功させるためのいくつかの重要なポイントがあります。

第一に、硬化冠動脈系への空気の混入を防ぐことが極めて重要です。第二に、すべての静脈および人工物を特定し、適切に封鎖することが重要です。そして第三に、動作およびカップラー蛍光染料の使用量を最小限に抑え、励起光への曝露を可能な限り減らすことが重要です。

ここで示した心内膜・心外膜マッピング手法の開発により、研究者は、複雑な心室性不整脈の極めて関連性の高い動物モデルにおいて、波の伝播ダイナミクスを従来よりも詳細に探索することが可能になります。