細胞ネットワークの作成のためのプラズマのリソグラフィ表面パターニング

本実験の全体的な目的は、マイクロおよびナノスケールの次元で起こる個々の細胞および細胞集団の挙動に関する生物学的問題を研究するための細胞微小環境を構築することである。これは、まず細胞の配置を誘導するためのテンプレートを設計し、次にそれらの設計をフォトリソグラフィによってパターン表面へと変換することで達成される。これにより、ソフトリソグラフィを介してプラズマ遮蔽モールドを作成することが可能となる。

最後に、これらの遮蔽用モールドをペトリ皿の中で三脚状に配置し、下層表面をプラズマに選択的に曝露させます。これにより、各モールドの下の領域に細胞感受性の化学パターンが形成されます。その結果、細胞の挙動がその微小環境や隣接する細胞との相互作用にどのように依存するかを示す結果を得ることができます。この手法は、細胞群の間の相互作用が高次現象にどのように影響するかなど、微小環境が細胞挙動に及ぼす影響に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。

また、細胞内ナノスケールの手がかりは、正常な遊走や分化などの機能にどのように影響するのでしょうか？まず、瞬間接着剤を使用して、パターンスライドを空のスライドのスタックに貼り付けます。次に、スライドのスタックよりもわずかに大きく、30 gのポリジメチルシロキサン（PDMS）を保持できる大きさのアルミホイルの容器を作成します。

スライドグラスのスタックを容器に入れ、その上にPDMSを流し込んで初期型を作成します。次に、容器を真空チャンバーに入れてPDMSを脱気します。吸気バルブのチューブを指で素早く押したり離したりして、チャンバー内に一時的に空気を流入させる操作を数回繰り返し、PDMS内に残っている気泡を除去します。

バルブを閉じて、5分間中断することなく脱気させます。その後、クリーンフローフード内の室温で、PDMSを1〜2日間硬化させます。硬化した後、PDMSをマスターパターンから剥がして、モールドを作成します。

次に、混合後1分経ったばかりの2液性エポキシ樹脂6 gを、マスターモールドに薄く流し込みます。エポキシ樹脂が硬化する前に、気泡除去サイクルを繰り返し行い、直ちに脱気します。脱気したエポキシ樹脂を1時間静置すると、部分的に硬化します。

後の工程での取り扱いを容易にするため、脱気せずにエポキシ樹脂をさらに型に加えて、構造を厚くします。その後、エポキシ樹脂を1〜2日間硬化させます。エポキシ樹脂の型が硬化した後、PDMSマスターモールドから取り出し、エポキシ樹脂の型の周囲にテープを巻いて容器を作成します。

次に、エポキシ型にPDMSを流し込み、PDMSを脱気して1〜2日間硬化させることで、ワーキングモールドを作成します。ワーキングモールドが硬化した後、エポキシ型からモールドを剥がし、清潔さを維持するため、両方をペトリ皿に入れ、フローフード内の密封プラスチック容器に保管します。表面パターニング用のモールドを準備するには、カミソリでワーキングモールドを小さく切断し、その切断片をペトリ皿に入れます。

これらのモールドセクションの位置を、シャーレの裏側に油性マジックでセクションが配置されている場所に沿って輪郭を描くことでラベル付けします。セクションを用いて三脚状に固定し、作動モールドとシャーレ表面が密着することを確認します。シャーレの底面を確認し、肉眼または小型の拡大鏡で確認できるチャネルが存在することによって、適切に配置されていることを確認してください。このアセンブリをプラズマチャンバーに入れます。

プラズマ処理の後、プラズマ処理を開始します。型とウェイト配置を取り除き、滅菌のためにシャーレをバイオセーフティキャビネット内のUVライト下に10分間置きます。細胞を播種するまで、シャーレをそのまま保管してください。

任意の実験用細胞を、目的のコンフルエンスに達するように標準的な培養培地で希釈します。パターニングされたペトリ皿の表面に配置し、細胞懸濁液 3 mL をペトリ皿に注ぎます。パターニングされたペトリ皿を 37 °C、5% CO2、100% 湿度で数時間から数日間インキュベートし、プラズマ細胞によって作成されたパターン上に細胞を集合させます。

パターン形成は位相差顕微鏡で確認します。神経芽細胞腫細胞を培養する場合、細胞がニューロン様の状態に分化するまで、10 µMのレチノイン酸を毎日添加してください。標準的な細胞培養培地は3〜4日ごとに交換します。

プラズマリソグラフィー技術を適用した際の典型的な結果として、任意の構造や自然界の構造に似た細胞パターンが形成されます。その例として、こちらの図では、ラインパターン上でレチノイン酸を用いて分化させたニューロンが示されています。また、こちらの図ではニューロンのラインおよびネットワークが作成されています。次の2つの図に見られるように、ニューロン以外の細胞型も使用可能です。この図ではヒト臍帯静脈内皮細胞が、そしてこちらの図ではC2C12骨格筋細胞が、ここに見られるように格子状に形成されていることがわかります。

ポリリジンなどの材料をパターニングすることで、特定の細胞種の接着を促進したり、その他の用途に利用したりすることも可能です。この手順に続き、マイクロ流体デバイスの導入、細胞プロービング、あるいは特定のタンパク質の遺伝子操作などのさらなる入力を組み合わせることで、「刺激の組み合わせが、高次および個々の細胞行動にどのように影響するか」といった追加の疑問に対する検証を行うことができます。