自動ワイヤの筋運動記録法を用いた腸間膜動脈の収縮と弛緩の研究

この手順では、フェニレフリンによる緊張下における腸間膜抵抗動脈の細胞外カルシウムに対する反応性を比較するため、Dahl塩感受性ラットおよび塩耐性ラットを使用します。まず、動物から腸間膜アーケードを単離し、抵抗動脈の分枝を切り出します。次に、2本のステンレス製ワイヤーのうち1本を切り出した動脈の短いセグメントに通し、血管をグラフチャンバーに固定します。

次に、1本目のワイヤーと平行になるように、2本目のステンレス製ワイヤーを血管腔に通します。続いて、固定した血管を標準的な内周まで伸展させます。本手順の最終ステップとして、フェニレフリンを繰り返し投与して血管を収縮させ、その後カルシウムを累積的に投与して弛緩させることで、血管の反応性を再確認します。

最終的に、血管内の張力の変化が結果として示され、これをカルシウム応答曲線に変換することで EC 50 値を決定することができます。比較として、ラットの Masonary batteries の神経ネットワークが gpro銅カルシウム感受性受容体を発現していることを発見した際に、まずこの手法を用いるというアイデアを得ました。

これは、アゴニストによって活性化される苦味 AIC 受容体と同様の方法で研究することができます。一般的に、この手法に不慣れな人は、内皮層および平滑筋層が薄いため、操作に苦労することがあります。血管は損傷しやすいため注意が必要です。

これが起こると、これらの血管の機械的特性が損なわれる可能性があります。まず、作業領域と手術器具を準備します。麻酔をかけた動物を仰向けに固定し、腹部をアルコールで拭きます。

正中切開による開腹後、上腸間膜動脈を含む約85 cmの腸管をハサミを用いて切除します。近位端は幽門付近で、遠位端は回盲部付近で切断してください。切除した部位を、室温の生理食塩水またはPSSを含むコーティング済みペトリ皿に入れます。

腸の近位端を右側に固定し、次に残りの腸を反時計回りに固定します。続いて、分枝2および3を含む腸間膜動脈の一節と、近位端からの腸の一部を剥離します。腸間膜動脈のV字型の分岐点を特定し、静脈から剥離します。

ピンセットを使用して、脂肪組織および結合組織を慎重に剥離し、動脈に直接触れないようにします。血管の固定を開始するために、約2 mmの長さの動脈セグメントを2本切り出します。動脈の内腔を開くには、4 cmの長さで40 µmのタングステンフリーステンレス鋼ワイヤーの先端を使用しても構いません。

次に、精密ピンセットを用いて、各動脈の管腔内にワイヤーを挿入します。内皮を傷つけないように注意しながら、筋移植片チャンバーに37 °CのPSSを満たします。ピンセットを使用して、ワイヤーが通った血管セグメントをチャンバー内に移動させます。

次に、切り出した近位血管セグメントをマイオグラフチャンバーに移し、ワイヤーに沿って末端を引き込み、血管内に挿入します。この際、血管を伸ばしすぎないように注意してください。ワイヤーの近位端を、マイクロメーターに接続された右側ジョーの近位固定ネジの下に反時計回りに固定します。

ピンセットでワイヤーの自由端を掴み、右側ジョーにある遠位の固定ネジの下に時計回りに固定します。このとき、ワイヤーに沿った血管セグメントがジョー自体に接触することなく、ジョー間の隙間に位置していることを確認してください。ジョーを回して間隔を広げます。2本目のワイヤーを血管と平行に合わせ、管腔の遠位端に挿入します。

すでに装着されているワイヤーをガイドとして、ワイヤーを血管セグメントの内腔に一度の動作でゆっくりと挿入します。操作中にワイヤーを伸ばさないよう、また内皮に触れないように、血管から約1cm離れた位置でワイヤーを保持してください。ジョーをネジで締め付け、右側に固定された1本目のマウントワイヤーの下を2本目のマウントワイヤーが通過していることを確認します。

トランスデューサーに接続された左側ジョーの近くの固定ネジの下に、2本目のワイヤーの近端を時計回りに固定します。ワイヤーの遠端を左側ジョーの固定ネジの下で固定し、締め付けてワイヤーを伸ばします。装着完了後、37 °Cで30分間平衡化させます。

平衡化した後、マウントメニューからモーターをリセットし、血管を正規化された内周まで伸展させる正規化手順を開始します。まず、正規化メニューを開き、目標経壁圧を13.3 kilopascalsに設定します。次に、各正規化ステップの時間を60 secondsに設定します。

IC 1からIC 100の比率は0.9とし、IPキャリブレーションは2スターデルタに設定します。血管セグメントの両端にヘアラインが位置した状態で、顕微鏡接眼レンズの読み取り値を用いて、固定した腸間膜動脈の長さを測定します。正規化後、一連の刺激と洗浄期間からなる標準的なスタート操作を行い、血管を再活性化させます。

まず、筋腔のカバーを付け替え、95%空気および5%二酸化炭素によるエアレーションを開始します。腔内に100 µMのアスコルビン酸を含む新鮮なPSSを満たします。5 µMのフェニレフリン（PE）で5分間血管を収縮させ、PSSバッファーで4回洗浄します。最後の洗浄後、腔内にPSSを再度満たし、3分間待機してから、再びPSSを満たしてPEで収縮させます。既報の通り、これで動脈の実験準備が完了します。

塩化カルシウムを累積的に添加し、濃度を上昇させることで、収縮した血管の弛緩を測定します。この表は、フェニレフリン投与後の基底張力が、Wistar DS（Doll塩感受性）ラットとDR（Doll塩耐性）ラットの間で異なっていたことを示しています。Wistarラットを用いたこのトレースでは、累積的なカルシウム添加によるPE収縮動脈の弛緩が示されています。DSラットの組織では、Wistarラットやここに示すDRラットと比較して、弛緩が著しく損なわれています。カルシウム感受性の差は、カルシウム反応曲線およびEC₅₀値の算出結果から確認できます。

最終的に、DSラットでは、Dr.Ratsと比較して動脈におけるカルシウム感知受容体の発現が減少していることが示されています。習得すれば、この手法は適切に実施することで2時間で完了できます。このビデオを視聴することで、等尺性条件下での外来化合物に対する小腸腸管動脈の血管反応性を比較する方法について、十分に理解できるはずです。