トータルRNAの単離およびダウンストリーム次世代シーケンシングと遺伝子発現プロファイリングのための離散マウスの脳領域のマイクロダイセクションのための非レーザーキャプチャー顕微鏡のアプローチ

この手順の全体的な目的は、再現性があり、一貫しており、コスト効率が高く、かつRNaseフリーな方法で、個別の脳核から全RNAを回収することです。まず、RNaseフリーの作業環境を整え、断頭させたマウスから全脳を取り出すことでこれを達成します。次に、マイクロメーター操作の組織チョッパーを使用して、均一なサイズの連続組織切片を作成します。

次に、組織をRNAフリーの培地環境に保持したまま、規定の直径の組織コアを用いて目的の脳領域をマイクロダイセクションします。最後に、摘出した脳核から全RNAを単離します。最終的に、分光光度法または蛍光光度法によるアッセイを通じて、下流のcDNAライブラリ調製およびトランスクリプトーム解析に十分な全RNAの収量と品質が得られていることを確認できます。

肉眼的な解剖学的切除やレーザーキャプチャーマイクロスコピーを用いた脳領域切除などの既存手法に対する本手法の主な利点は、個々のマウスの脳から複数の離散的な関心脳領域を、再現性がありコスト効率の良い方法で回収できることです。この手法は、神経回路が存在しない脳領域内の異なる転写物発現プロファイルが、特定の行動特性、環境応答、あるいは疾患状態で相関しているかなど、神経科学分野における重要な疑問の解明に寄与します。マイクロダイセクションの準備として、100 millilitersのEarls平衡塩溶液（EBSS）に、0.44 gramsの重曹と0.884 gramsのグルコースを添加します。

オートクレーブ対応のねじ口ボトルまたはフラスコ内で、EBSSを0.1 millilitersのDEPCで37 °Cで12時間以上処理します。5.75 inchesのガラスピペットを1 literのガラスビーカーに入れ、絵筆を剛毛を上に向けて100 milliliterのガラスメスシリンダーに入れます。

ピペットとブラシが浸かるまで、十分な量のDEPC処理水溶液を加えます。ビーカーとメスシリンダーをアルミホイルで覆い、37°Cで12時間以上インキュベートします。DEPCによる12時間のインキュベーション後、すべてのDEPC処理済み材料を100°C以上の温度で15分以上加熱します。冷却し、EBSSを室温に戻してから4°Cで保存します。

ビーカーとメスシリンダーからDD H2Oを捨て、材料が乾燥するまで100 °C以上でインキュベーションを続けます。インキュベーターから取り出し、室温まで冷却して、後で使用するまで保管します。実験当日は、すべての作業面を処理してRNA汚染を除去し、EBSSを40 °Cに設定したウォーターバスに置き、緩衝および酸素供給を行います。

ガスチューブをRNAフリーのパスツールピペットに入れ、EBSSに5%CO2と95%酸素を飽和させます。ピペットをEBSSに挿入し、EBSS容器の開口部を塞ぎます。脳組織の連続切片作成のため、組織スライサーを準備します。

組織スライサーの上面と底面を処理します。RNA汚染を除去するため、ティッシュチョッパーのプレキシガラス表面に、長方形に切ったWhatman No.4ろ紙を貼り付けます。チョッパーアームに両刃のカミソリ刃を取り付けます。

マイクロメーターをゼロに設定し、カッターブレードがフィルターペーパーを切断し、プレキシガラスプレートを切断しないように、チョッパーアームの最低高さを調整します。RNAフリーの60×15 mmセルカルチャーディッシュ、組織採取用200 µL RNAフリーマイクロピペットチップ、曲剪刀、ドライアイス、および組織回収用チューブなど、マイクロダイセクションに必要なすべての追加材料を準備します。齧歯類用ギロチンを用いてマウスを断頭し、後脳と視神経を両方とも温存した状態で全脳を取り出した後、チューブをドライアイス上に配置します。

脳を60×15 mmのRNaseフリー細胞培養ディッシュの上部に置きます。次に、それを組織サンプリング作業面に移動させます。RNaseフリーピペットを使用して、組織チョッパーに取り付けられたフィルターペーパーをEBSSで控えめに湿らせます。

脳組織をEBSSで湿らせます。脳をティッシュチョッパーに移し、腹側がフィルターペーパーに接するように配置します。正中線がチョッパーの刃に対して垂直になり、脳の吻側端が刃に接するようにしてください。

A-D-E-P-C処理したアートブラシを用いて、脳の背面（dorsal surface）に緩やかに圧力をかけ、脳を静止させた状態で保持します。ブレードホルダーレバーを背面組織の表面から約4〜5 cm持ち上げ、その位置で保持します。脳表面からブラシを離し、750 µmにダイヤルを合わせます。

マイクロメーターを使用します。レバーを下げて組織を切断し、チョッパーブレードを静止させたまま750 µmの冠状断切片を作成します。アーティストブラシを転がすように動かし、組織切片をブレード表面からそっと拭い去ります。

組織切片をすぐにペトリ皿内の酸素飽和EBSSに入れてください。これで、このスライスをマイクロダイセクションに使用できる状態になります。吻側から尾側の平面全体にわたって連続的な脳切片が得られるまで、スライシングの手順を繰り返し、マイクロダイセクションを実施します。

まず、サンプルの照明が遮られないことを確認します。組織に対して緩衝酸素化環境を維持するため、O2 CO2混合ガスの位置と流量を調整します。操作中に、関心領域を含む脳の冠状断切片を特定し、絵筆を用いてペトリ皿の底に平らに配置します。

適切な直径のティッシュコアを選択します。アーティストブラシで冠状断の組織切片を固定し、ティッシュコアの切削先端を組織切片の表面に合わせます。圧力をかけながら、ティッシュコアの先端を組織切片に貫通させ、ペトリ皿の底までしっかりと押し込みます。

回転させるように円を描く動作を行い、目的の領域が周囲の組織から遊離していることを確認します。画筆を用いて、組織コアを組織切片から慎重に持ち上げ、マイクロパンチを遊離させてEBSS内に浮かび上がらせます。直ちに、ドライアイス上に保持した-80°Cの安定保存チューブに組織マイクロパンチを投入してください。

組織はチューブの側壁に容易に付着するはずです。マイクロサンプルの入ったチューブをドライアイスに戻します。目的とする各脳領域について、このマイクロダイセクションを繰り返します。

マイクロダイセクションが完了したら、各サンプルが入ったチューブのラベルまたはバーコードを記録します。組織サンプルからRNAを抽出するため、RNA抽出まで組織サンプルを-80°Cのフリーザーで保存します。まず、RNaseフリーのワークスペースを準備してください。

total RNA isolation kitのマニュアルに従い、十分な量の磁気ビーズミックスと溶解結合溶液を調製します。組織サンプルを-80 °Cのフリーザーから取り出し、チューブを直接ドライアイス上に置きます。サンプルの入ったチューブに溶解結合溶液を100 µL加えます。

ペレットミキサーにヌクレアーゼフリーの0.5 mLチューブ用ペッスルを取り付け、低吸着ヌクレアーゼフリーピペットチップを用いて組織をホモジナイズします。ホモジナイズしたサンプルを、同種のチップを用いて直ちにラウンドボトム96ウェル組織培養プレートのウェルに分注します。サンプルに100%イソプロパノールを60 µL加えます。

ビーズミックスを20 µLサンプルに加え、ピペッティングで3〜4回混ぜ合わせます。全RNA抽出キットのプロトコルの手順に従い、全RNA抽出を完了させてください。最後に、得られた全RNAの純度と濃度を測定します。さまざまな脳領域のマイクロパンチから得られた全RNAのデータをこの表に示します。

提供された30 µLの溶出バッファーで溶出したRNAサンプルは、RNAシーケンシング用途の市販CD NA調製製品に使用するのに十分な全RNA量でした。さらに、RNA収量および260/280比は、各脳領域から得られた測定値を実証するために、それぞれのマイクロダイセクションサンプルから得られた単一の値であり、サンプルが高い純度であることを裏付けています。習熟すれば、適切に実施した場合、この手法は8～10分で完了できます。この手順を行う際は、RNAフリーまたはDEPC処理済みの材料のみを使用し、作業面や組織サンプルへのRNA汚染のリスクを最小限に抑えることが重要です。