シングルセルRT - PCR技術を用いて黒質神経細胞に電位依存性カリウムチャネルのmRNA発現のプロファイリング

本手順の全体的な目的は、個々のニューロンにおけるメッセンジャーRNAを検出することです。これは、パッチクランプを用いて個々のニューロンを記録し、その後、記録した各ニューロンからMr.mRNAおよび細胞質を含む細胞質を完全に吸引することで達成されます。その後、cDNAを合成し、PCRによって増幅させます。

最終的に、受容体、イオンチャネル、および酵素の特定のmRNAを、従来のゲルイメージングシステムを用いて検出することができます。私はテネシー大学ヘルスサイエンスセンターで研究を行っています。一般的に、この手法に慣れていない方は、単一のニューロンに含まれるmRNAの量が極めて少なく、失われやすいため、操作に苦労することがあります。

まず、バイブレーターを用いて、黒質の前部を含む300 µm厚の冠状断脳切片を作製します。脳は15日から40日のSprague Dawleyラットから摘出します。切片作製の手順は、95%酸素および5%二酸化炭素で酸素化し、pH 7.4に調整した高濃度ショ糖切削溶液中で氷冷状態で実施します。切片を、5%二酸化炭素および95%酸素ガスをバブリングした人工脳脊髄液中でインキュベートします。

温度を34 °Cに維持し、スライスを45分間静置します。その後、記録を行うまで脳スライスを室温で保持します。まず、脳スライス1枚をパッチクランプ記録チャンバーへと移します。

32°Cの酸素飽和人工脳脊髄液で連続灌流させます。オートクレーブ滅菌済みのDNaseおよびRNaseフリー水で調製した細胞内液をパッチピペットに充填します。充填したピペットをバス内に下げます。

抵抗値が2〜3MΩの間であることを確認します。まず、解剖学的な特徴的な位置から黒質を特定します。次に、NAMAR光学系と60倍の対物レンズを用いて、記録対象となるSNCおよびSNR内の大型細胞を選択します。

これらは間違いなくドパミン作動性またはGABA作動性ニューロンであると考えられます。従来のギガシール・ホールセル法を用いて、カレントクランプおよびボルテージクランプ測定を行ってください。mRNAの分解を最小限に抑えるため、これらの記録は通常5分以内に完了させる必要があります。

約1分で、細胞膜特性とスパイク特性を記録するだけで、目的のニューロンの電気生理学的フィンガープリントを提示することが可能です。目的のニューロンからデータを取得した後、口で静かに吸引して細胞質を吸い出します。このとき、密なシールが破れないように注意してください。

mRNAを含む細胞外のデブリがパッチピペットに吸い込まれ、細胞内容物を汚染する可能性があります。ピペットチップを切り離し、軽い正圧をかけることで、細胞内容物を0.2 milliliterのPCRチューブに排出してください。終了後、mRNAを含む可能性のある細胞外デブリによる汚染を防ぐため、直ちにチューブを-20°Cのフリーザーに保管してください。

吸引を行わず、組織内に導入したパッチピペットの内容物を回収して、ネガティブコントロールを作成します。10〜20個のニューロンから細胞内容物を回収した後、直ちに逆転写反応を開始してください。mRNAの分解を最小限に抑えるため、まずDNaseを用いて、25 °Cで5分間、混入したゲノムDNAを消化します。

このステップは潜在的な偽陽性を減らすために極めて重要であり、省略してはいけません。次に、1.2 µLの25 mM EDTAを用いてDNAを不活性化し、サンプルを70 °Cで5分間インキュベートします。続いて、市販のキットを用いてCD NAを合成し、ゲノムDNAが完全に除去されたことを確認します。

逆転写酵素を除いた各サンプルのコントロール反応を行います。その他の反応成分はすべて同一のままにします。生成物は、PCR設計に使用するまで-20°Cで保存してください。

GenBankの配列に基づいたプライマーを使用し、可能な限り、ゲノムDNAの混入を検出するためにイントロンを跨ぐプライマー設計を行ってください。プライマーペアの有効性を確認するため、第一段階として全脳cDNAを用いてテストします。標準的なサーマルサイクリングプロトコルに従い、30 µLのcDNAのうち5 µLを35サイクルでPCR増幅させます。

第2段階では、第1段階のPCR産物1 µLを同じプライマーセットでPCR増幅し、わずかに変更したサイクリング条件を用います。次に、産物を2.5% AGROSゲルで分離し、AuM bromideまたはGelGreenを用いて可視化します。UVライト下で目的のDNAバンドを切り出し、市販のキットを用いてDNAを回収し、シーケンシングを行います。

黒質緻密部および黒質網様部のニューロンにおける電気生理学的特性を比較しました。SNRのGABA作動性ニューロンは、約10 hertzのより高頻度な自発的スパイクを示しました。これらのスパイクは、過分極電流の注入時に約1 millisecondの基本持続時間を有していました。

SNR GABA作動性ニューロンは、弱い活性化電流を示すわずかなSAG反応を示しました。対照的に、黒質ドパミン作動性ニューロンは、基底持続時間が約3ミリ秒の低頻度自発スパイクを示しました。また、ドパミン作動性ニューロンは過分極に対して顕著なSAGを示しましたが、これはSNR GABA作動性ニューロンにおいてIH電流が強く発現しており、ドパミン作動性ニューロンでは発現していないことを示しています。

シングルセルRT-PCRにより、GABA合成の鍵となる酵素であるグルタミン酸脱炭酸酵素1のmRNAが検出されました。対照的に、シングルセルRT-PCRにより、ドパミン合成の鍵となる酵素であるチロシン水酸化酵素のmRNAが、特定されたSNCおよびSNRのドパミン作動性ニューロンでは検出されましたが、GABA作動性ニューロンでは検出されませんでした。

次に、単一細胞RT-PCRを用いて、電位依存性カリウムチャネルの特性を変化させる電位依存性KV3チャネルサブユニットの発現プロファイルを解析しました。SNR GABAの例では、あるSNR DAニューロンのみにおいて、KV3.1、3.2、3.3、および3.4のニューロンmRNAが検出されました。また、プールされたデータでは、KV3.2、3.3、および3.4が検出されました。

KV 3.1は、黒質ドーパミン作動性ニューロンよりもSNR GABA作動性ニューロンでより頻繁に検出されており、高速発火するSNR GABAニューロンにおけるKV 3.1の高発現レベルが示されました。この手順を行う際は、必ず手袋を着用し、使用後の器具を清潔に保つことが重要です。この手法は、神経科学分野の研究者が神経系における受容体およびイオンチャネルの発現と機能を探索するための道を開きました。