ヘキストの分離および特性評価^低 CD45^負マウス肺間葉系幹細胞

このビデオでは、ホストのCD45陰性肺間葉系幹細胞を単離するためのプロトコルを実演します。組織常在性間葉系幹細胞（MSC）は、組織の修復や再生、線維化、炎症、および血管新生において重要な調節因子です。まず、犠牲にしたマウスから肺を摘出します。

肺組織を消化して単一細胞懸濁液を得ます。細胞をhoax dyeおよびCD 45で染色し、フローサイトメトリーにより分取して、ホスト由来のCD 45陰性肺MSCを取得します。その後、肺MSCを培養して増殖させ、コロニー形成アッセイを行い、MSCの分化能を評価します。

その後、組織の恒常性維持および疾患におけるMSCの役割を調べるために、さらなる研究を行うことができます。本手法は、マウスまたはヒトの肺間葉系幹細胞の単離に使用でき、肺線維症、肺高血圧症、COPDなどの肺疾患の研究に適用可能です。一般的に、この手法に不慣れな方は、組織調製法の多様性に加え、フローサイトメーターのセットアップ、適切なコントロールの選定、および解析において困難を伴う可能性があります。

肺組織を細切し、細胞の生存率を最適にするための適切な消化技法を言葉だけで説明することは困難であるため、本手法の視覚的なデモンストレーションが不可欠です。また、フローサイトメトリー装置のセットアップと解析についても、デモンストレーションを通じて伝えるのが最適です。まず、犠牲にした成マウスから、間葉系幹細胞の採取に使用する肺を取り出すことから本プロトコルを開始してください。

小さめの鋭い鋏を用いて、マウスの肋骨を両側から横方向に切断します。胸腔を開き、横隔膜を除去します。20.5ゲージの針を装着した10 milliliterのシリンジを右心室に挿入し、プランジャーをゆっくりと押し下げて3～5 millilitersのPBSで灌流させ、肺から血液を洗い流します。

次に、ハサミを使用して気管と主気管支を切り取り、廃棄します。続いて、ピンセットで小さく白い肺葉を摘出し、Hanks平衡塩類溶液（HBSS）を満たしたシャーレに入れます。

次に、心臓を取り除き、肺葉を分離します。この工程を、研究に用いるすべてのマウスに対して繰り返します。分離した肺葉をディッシュの蓋に移します。

組織が乾燥しないように、十分な量のHBSSで湿らせます。次に、使い捨てメスを使用して肺葉を細かく刻み、フローサイトメトリーの維持コントロールとして使用する骨髄を採取します。鋭い鋏を用いて、足首と大腿骨の上端を切断します。

肢を新しいペトリ皿に移します。次に、膝の部分を切断し、大腿骨の直線的な一部と、脛骨および腓骨を含む別の部分に分けます。ピンセットを用いて筋肉を取り除き、脛骨、腓骨、および大腿骨を露出させます。

次に、26.5ゲージの針を装着した5 mLシリンジを用意し、針を骨髄の開口部に挿入します。脛骨の一端を持ち、もう一端を15 mLのHBSSを満たした50 mLコニカルチューブに向け、プランジャーを押してHBSSを注入し、骨髄をチューブ内に洗い出します。腓骨と大腿骨についても同様の手順を繰り返します。

補充剤添加高グルコースDMEMを用い、最終濃度5 µg/mLのhost 3 3 3 4 2 dyeで骨髄を染色します。次に、単離した肺組織から単一細胞懸濁液を作製します。各肺を、あらかじめ温めた0.2% Worthingtonを含むチューブに入れます。

滅菌済みのHBSSでType two collagenaseを調製し、チューブを37°Cのウォーターバスに浸して30分間インキュベートします。インキュベーション後、10 mLピペットを用いて、消化物がピペット内をスムーズに流れるようになるまでサンプルをトリチュレーションします。これを約10回繰り返し、組織の消化を完了させるため、37°Cでさらに15分間インキュベートします。

消化が完了したら、細胞懸濁液をHBSSで希釈し、5 mLピペットを用いて、残っている組織片を分散させるために再度トリトン処理（または撹拌）を行います。次に、未消化の組織片を除去するため、懸濁液を70 µmのセルストレーナーを通して50 mLコニカルチューブに回収します。サンプルがセルストレーナーを通過するように、懸濁液を少しずつ加えてください。

未消化の組織片によって細胞懸濁液の流れが完全に遮断された場合は、新しいセルストレーナーを用いて新しいチューブにろ過してください。その後、細胞懸濁液を450 RCFで10分間遠心し、ペレット化します。

遠心後、上清を除去し、室温の赤血球溶血バッファーで細胞ペレットを穏やかに再懸濁させ、室温で5分間インキュベートします。その後、等量のHBSSを加えて溶血バッファーを不活性化します。

細胞懸濁液を40 µmのセルストレーナーに注ぎ、デブリや細胞凝集塊を除去し、ろ液を新しい50 mLコニカルチューブに回収します。次に、血球計数器を用いて、肺および骨髄の両サンプルの細胞数を算出します。細胞懸濁液の濃度と総量を記録してください。

次に、単一肺細胞懸濁液を450 RCFで10分間遠心分離してペレット化します。細胞を維持するため、肺細胞と骨髄細胞の両方を、あらかじめ温めておいたサプリメント添加高グルコースDMEMで一度に10^6 cells/mLの濃度で再懸濁します。

DNAを染色するために、HOAXED 3 3 3 4 2 染料を最終濃度 5 µg/L になるように加えます。次に、細胞を緩やかに転倒混和し、37 °C のウォーターバスで正確に 90 分間インキュベートします。その後、4 °C で 450 ×g により 10 分間遠心分離します。

フローサイトメトリー分析の準備として、肺および骨髄組織を抗CD 45およびプロピジウムヨードで染色します。細胞の染色後、フローサイトメトリー分析を行うまで、チューブを遮光して氷上に保存してください。機器のレーザーアライメントを確認し、セルソーティングの設定を行うことで、フローサイトメトリーの準備を整えます。

使用する装置は、488 nmの青色レーザー、635 nmの赤色レーザー、および350〜355 nmのUVレーザーを備えている必要があります。また、UVレーザー経路には2つの検出器があり、青色用には45/65フィルター、赤色用には675/50フィルターが装着されていなければなりません。さらに、UV赤色検出器は赤色信号に対して高感度である必要があり、サンプルを10 °Cに維持するためのチラーユニットが装置に備わっている必要があります。装置のソフトウェアでは、線形前方散乱（forward scatter）対側方散乱（side scatter）を表示するヒストグラムプロットと、その装置に適したダブレット識別プロットを設定してください。

対数シグナルを用いたPIのヒストグラムプロット、線形シグナルを用いた赤色対青色の相関図、および対数シグナルを用いたCD 45 A PCのヒストグラムプロットです。装置の準備が整ったら、染色済みの骨髄サンプルを装置のローディングポートに設置します。このサンプルは、染色および装置セットアップのコントロールとして使用されます。

イベントの収集を開始し、前方散乱光（FSC）および側方散乱光（SSC）の線形信号を調整します。細胞集団を明確に視覚化するためには、前方散乱光をx軸としたプロットにおいて、細胞がおおよそ中央下に位置するように設定してください。核染料であるPIは細胞膜を透過しないため、生存細胞からは排除されます。

PIヒストグラムにおいて、PI陽性の死細胞にゲートを設定します。機器のソフトウェアを用いて、このゲート内の死細胞を赤色に色付けするように設定してください。

死細胞を色分けして表示し、それをナビゲーターとして利用することで、宿主のG0/G1集団を特定するのに役立ちます。PI染色はUVレーザーによっても励起されるため、死細胞の大部分はスケール外に表示されるはずです。赤色対青色の蛍光プロットの右側において、骨髄のG0/G1集団は、イベントが密集したクラスターとして確認できるはずです。

検出器の電圧を調整し、プロットの中央右上方にG0/G1クラスターが位置するようにします。細胞周期のS期の大部分およびG2期全体がスケール外になる場合があります。赤色対青色のHoechstプロットの右上では、サイドポピュレーション（SP）が、G0/G1クラスターの左側からプロットの左下隅に向かって伸びているのが確認できます。

次に、FSC対SSCのプロットにおいて細胞クラスターを囲むゲートを作成します。ダブレットプロットで特定したシングレット集団と、PIヒストグラムにおける生存細胞をプロットします。その後、これらのゲートされた集団のみが表示されるようにhoaxプロットを割り当ててください。

ホストプロットをゲーティングした後、サイドポピュレーションの周囲に領域を描画します。この領域を、ライトスキャッターのシングルレットおよび生細胞ゲートとともに、CD 45 A PCヒストグラムのゲートとして割り当てます。システムのセットアップが完了したら、ローディングポートからサンプルを取り出し、肺サンプルをローディングポートに配置します。

このサンプルについて、装置の設定を再度調整する必要はありません。赤色対青色の擬似プロット（hoax plot）でイベントの収集を開始します。肺サンプルのG zero G oneクラスターは、通常、x軸方向に長く伸び、キーボードのチルダ記号（~）に似た形状になります。

サイドポピュレーション（SP）ゲートの下限は、骨髄サンプルの設定と同様の位置にする必要があります。SPの高解像度な分離を確実にするため、上下にわずかな調整が必要になる場合があります。ソーティング中は、サンプルフローバルブを開けすぎないようにし、圧力差を低く維持してください。

MSCを単離するために、ソートチャンバーに96ウェル回収プレートを設置し、CD 45 A PCヒストグラム上でソートゲートを設定して、陽性集団と陰性集団を分離します。最後に、混合集団としてチューブに回収するか、クローンを単離するために96ウェルプレートにシングルセルとして回収します。セルソーティングによる肺MSCの回収後、細胞を20% FBSを添加したA MEMを用いて30 mmディッシュに播種します。まず、ソートされた細胞は約2〜3週間後に小さく、丸く、明るい外観となります。

間葉系表現型を持つコロニーが顕在化し、各細胞調製物において増殖がより明確になります。肺由来MSCが、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞という伝統的な間葉系系譜に分化する能力、および公認の間葉系マーカーの細胞表面発現を評価します。細胞遺伝学的バンディング解析を行い、粗大な染色体異常がないことを確認します。

フローサイトメトリーによる分離およびシングルセルクローンの調製後、MSC細胞の特性および分化能を評価するためにコロニー形成アッセイを行います。まず、細胞を1 mLあたり3×10⁴個に希釈します。100 mmディッシュ内の不完全CUL培地を用い、1枚あたり2×10⁴、6×10⁴、3×10⁴、1.5×10⁴、0.75×10⁴個の細胞となるよう、10 mLの培地で3連（triplicate）の段階希釈を行います。

その後、10日間の培養後にプレートをインキュベーターから取り出し、培地を捨てて細胞をPBSで洗浄します。次に、室温で100%methanolを5分間加えて固定します。5分後、methanolを捨てます。

次にコロニー形成を検出するため、イオン水で20倍に希釈した0.4% (w/v) gzaを添加し、10〜15分間インキュベートします。その後、染色液を捨て、イオン水で洗浄します。サンプルを風乾させ、倒立顕微鏡または可視化装置を用いて、1コロニーあたり25細胞以上を含むコロニー数を定量します。

コロニーはここに示すように大きく、数百個の細胞で構成されており、間葉系表現型を示しています。MSCは本ビデオに示した方法で単離し、96ウェルプレートに播種して増殖させました。その後、停止させたCFSE標識抗原提示細胞を肺MSCに添加しました。

次に、単離したMSCの増殖能を、背景（この図に示されるCFSE標識T細胞のみの状態）と比較したCFSEの平均蛍光強度の減少として測定しました。肺SCが存在せず、抗原提示細胞が存在する条件下（APC ± OVA CD40陽性エフェクターT細胞）では、CFSE強度の低下が見られ、これは増殖を示しています（赤丸で囲まれた部分）。T細胞膜のCFSE蛍光強度は、細胞分裂のたびに幾何級数的に減少します（すなわち、分裂ごとに半分になります）。一方、肺MSCが存在する条件下（MSC + APC ± OVA CD40陽性エフェクターT細胞）では、CFSE強度に有意な変化が見られず、これは増殖が抑制されたことを示しています。この手法により、肺幹細胞生物学分野の研究者が、肺動脈性肺高血圧症や肺線維症などの肺疾患における間葉系幹細胞の役割を探索する道が開かれました。

この手法を習得すれば、本手順に従って約5時間で完了できます。想定される肺間葉系幹細胞が、骨、脂肪、軟骨への分化能を含む適切な多系統分化能を示すかどうかなど、さらなる疑問を解消するために、分化アッセイなどの他の手法を実施することができます。