大動物モデルにおける心血管デバイス用自家血管内皮前駆細胞播種技術と生体適合性試験

本実験の全体的な目的は、自家血由来の血管内皮前駆細胞を血管インプラントに播種し、大型動物モデルにおける血栓症への治療効果を観察することである。まず、ブタから末梢血サンプルを採取し、後期 outgrowth 豚内皮前駆細胞を単離する。次に、植込み型デバイスを...

概念実証研究では、チタンチューブに自家PCを配置しました。その後、このデバイスを豚の下大静脈に移植しました。その結果、対照群および閉塞したベアメタルチューブと比較して、EPCを配置したチタンチューブの開通性が維持されており、血栓症に対する保護効果があることが示されました。

デューク大学外科は、画期的かつ革新的な研究の促進に取り組んでいます。以下のプレゼンテーションは、医学を前進させるために私たちがどのように学部や専門分野を越えて連携しているかを示す一例です。EK博士は、血管デバイスの血液接触面に患者自身の前駆細胞をライニングすることで血栓症を防止する、細胞シーティング技術の開発に向けた研究を主導してきました。

これらの細胞はインプラントを移植する同一の患者から誘導されているため、免疫系による拒絶反応を回避することができます。今回の成果および本書で述べる手法は、大規模なチーム体制による努力の結果です。外科的移植の手技については、血管外科部門のSean Gage、デューク大学医学部の学生であるWhitney Lane、そして私が実演します。

それでは、生物医学工学科の博士課程学生であるAlexander Janssenさんに、細胞播種プロセスの詳細について解説していただきます。ここでは、ブタモデルに植え込む直前に、チタンチューブに血液由来の内皮前駆細胞を播種する方法を実演します。この手法は概念実証として機能し、同様の基本原理をニティノールステントや機械的循環補助装置など、他の多くの植込み型デバイスに適用することが可能です。EPCは、ブタ血液の単核細胞分画を播種することで単離され、通常は約7日後に現れます。

それらは典型的な石畳状の形態によって認識できます。培養中のEPCsを総数900万個まで増殖させます。準備したEPCsを無血清培地で2回洗浄し、ラベル化の間および後は光への曝露を制限するように注意してください。

次に、蛍光ラベルであるPKH 26で細胞を染色し、添加した溶液量を記録します。細胞を室温で4分間インキュベートします。1分後、色素溶液と同量の豚血清を添加して、標識反応を停止させます。

混合溶液を完全成長培地で1対1に希釈します。次に、液体を吸引し、完全成長培地で3回洗浄した後、カルシウムおよびマグネシウム不含DPBSで2回洗浄します。続いて、使用した容量を記録しながら、細胞にトリプシンを加え、37 °Cでインキュベートします。

3分間インキュベートした後、顕微鏡を用いて細胞が剥離したかを確認し、剥離していれば、添加したトリプシン中和溶液の2倍量を加えます。トリプシン処理後、細胞懸濁液を1本のチューブにまとめ、ヘモサイトメーターで細胞密度を測定します。最後に、細胞懸濁液を遠心してペレットとし、少なくとも4.5 millilitersの無血清培地で細胞を再懸濁します。

豚の手術準備が整ったら、第2乳腺から15番のメスを用いて正中線を切開します。電気メスを用いて、最後から2番目の乳腺まで慎重に切開を進めます。腹壁筋膜まで剥離を行います。

蚊針鉗子で腹膜を持ち上げ、メッツェンバウム剪刀で慎重に切開します。膀胱を体外に露出させ、膀胱壁に3-0 Vicrylで巾着縫合を施します。その中心を穿刺切開し、16 Frのフォーリーカテーテルを切開口から挿入します。その後、手術中の尿量を1 mL/kg/hr以上に調整するため、静脈内輸液を行います。

次に、拡張した小腸を体外へ出し、2つのbour外科用リトラクターを配置して腹腔の後面を露出し、鋭的および鈍的剥離を用いてIVCを同定します。周囲組織から注意深くIVCを剥離してください。その後、IVCの分枝遠位側から右腎動脈にかけて、血管を骨格化します。

下大静脈（IVC）の解剖時には細心の注意を払ってください。IVCに極めて小さな欠損が生じただけでも、急速な出血を招き、動物が失血死する可能性があります。IVCセグメントのすべての側枝を結紮してください。特に、IVCの分岐部の直近にある2本の大きな後腰静脈の解剖と結紮には十分注意してください。多くの場合、後側に大きな腰静脈が存在します。

この静脈を遊離するように剥離し、ベッセルループで固定します。次に、手術と並行して、この手順を開始する前にインプラントへのEPCsの播種を開始してください。チタンチューブ組織固定スキャフォールドは、完全に組み立てられ、無菌野で使用可能な状態でなければなりません。

ガス滅菌済みのチタンチューブアセンブリを5 ccシリンジに装着します。次に、5 ccシリンジからプランジャーを取り除きますが、廃棄せずに保管してください。シリンジに固定型アリュールキャップを装着します。ピペットを使用して、シリンジにEPC懸濁液を満たします。

その後、プランジャーを元に戻します。キャップを取り外し、シリンジのルアー端をアセンブリの開いたシリコンチューブに、ぴったりとはまるまで挿入します。さらに、細胞溶液をゆっくりと送り、ヘッドピースの最上部に到達するまで進めて気泡を取り除きます。

次に、ルアーキャップでアセンブリを閉じ、滅菌グローブ内でテープで密封します。このアセンブリ全体を専用のシリンジホルダーに挿入し、37 °Cのインキュベーターに入れます。ゲージを使用してシーティングチャンバーが水平であることを確認し、緩やかに回転させながらアセンブリをインキュベートします。

下大静脈（IVC）を結紮した後、ブタ1kgあたり100単位のヘパリンを投与し、手術を続行します。次に、IVCの遠位側と腰静脈を45度の角度で直ちにクランプし、続いて近位側をクランプします。次に、11番のメス刃とポットシザーを用いて、近位側と遠位側のクランプの間に4cmの縦方向の静脈切開を行います。

IVC内から血液をすべて排出し、滅菌DPBSで内腔を洗浄します。次に、細胞の乾燥を防ぎ空気を排出するため、EPCを播種したインプラントまたはベアメタルのコントロールをIVCに挿入します。IVCに塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを含むDPBSを満たします。

次に、4-0のプロリン連続縫合で静脈切開部を閉鎖し、近位側のクランプを1つ外して、少量の逆流出血により下大静脈（IVC）内の空気を抜きます。出血が止まった後、遠位側のクランプを外してインプラントを固定します。静脈壁を通過するPVCチューブに保持縫合を施します。

CT針に装着したOPDSを用いて筋膜を閉鎖します。次いで、2-0 Vicrylを用いて皮下組織を連続縫合で閉鎖します。最後に、皮膚をステープラーで閉鎖します。

切開部位に沿って0.25%Marcaineを最大20 milliliters皮下に投与し、疼痛緩和のため、傷口をガーゼとTegadermで覆います。必要に応じて、Flu Nixonとオキシモルホンを皮下に投与します。麻酔を終了し、豚が覚醒したら、その後7日間にわたってケージに戻します。

抗菌剤の予防投与としてatriを24時間ごとに投与し、手術前に貼付したフェンタニルパッチが合計3日間剥がれずに貼付されていることを確認する。3日後、埋設したチタン製チューブインプラントを回収し、内表面を観察した。550 nmの励起波長下において、別のチューブに蛍光標識された細胞がコンフルエントな層として認められた。

細胞境界を可視化するため、切片細胞を血小板内皮細胞接着マーカーで追加染色した。この手順では、多種多様な染色剤を使用することができる。対照的に、未処理のチタンチューブインプラントは、下大静脈の血栓形成を促進する低剪断応力環境において完全に閉塞する。

画像AおよびCに示すように、細胞が播種されたチタンチューブを画像Bに示します。これは、末梢血を用いた我々の単離手順の後、血栓が形成されていない状態を維持していました。EPCは、培養開始から平均7日後に出現します。外科的手術を行う際は、IVCを慎重かつ穏やかに剥離することが極めて重要です。なぜなら、IVCまたはその分枝にわずかな裂傷が生じただけでも、ブタの失血死につながる可能性があるためです。この手順の後、他の血液接触材料を迅速に内皮化させることで、血栓形成を防止できます。

例えば、我々のEPCを用いた血管内皮ステントは、血管壁の天然のライニングを模倣し、留置後のステント再狭窄や血栓形成を防止できる可能性があります。当社のクイックシー（Quick See）技術により、手術室やカテーテル室において、患者自身の血液由来の内皮前駆細胞を用いて、数分以内に血管内デバイスにライニングを施すことが可能になります。したがって、長期間のex vivo培養は不要となります。

デバイス自体の操作時間が削減され、この技術は臨床現場への導入に向けた実用性を備えることになります。