リグノセルロース系材料のためのハイスループット糖化アッセイ

こんにちは、私はKara Tedです。私はLeoです。よろしくお願いします。そして、私はSimon McQueen Masonです。

植物バイオマスの消化性は、現在非常に高い関心を集めているテーマです。これは、バイオマスを構成する植物細胞壁の多糖類に多くの糖が結合しており、これらの糖を利用可能な形態で抽出できれば、発酵させて燃料や化学物質など、あらゆる種類の製品を製造できるためです。残念ながら、これらの物質は極めて消化しにくいため、どのような要因がその消化性を制御しているのかをより深く理解することが急務となっています。

再生可能グループの生産に植物材料を利用するためには、これらの植物における糖化能を測定できる必要があります。そのため、ここヨーク大学では、植物材料の大部分をスクリーニングし、その糖化能を判定しています。糖化とは、複雑な炭水化物を単糖成分に分解し、さまざまな工業プロセスを通じて有用な化学物質を生産するプロセスのことです。

糖化能を測定するため、バイオマスに前処理と酵素加水分解を施して放出される糖を決定するという工業プロセスをマイクロスケールで再現します。これにより、遺伝子型における興味深い品種を特定します。このハイスループットシステムは、IG 6ウェルプレート形式で動作します。

ジェノタイプ間のわずかな違いを明らかにするために穏やかな条件での加水分解が行われ、この手法は異なる基質材料への対応や、さまざまな酵素の評価が可能な十分な柔軟性を備えています。本手法では、植物材料を粉末状に成形し、希酸または希アルカリを用いて90°Cで20分間前処理します。次に、市販のセルラーゼ混合物を用いて、50°Cで8時間の酵素消化を行います。

最後に、還元糖の放出量を決定するためにMBTH法を用います。植物材料を乾燥した茎として採取し、4 mmのセグメントに切断します。これらを、直径5 mmの金属ボール3個とともに2 mLバイアルに入れます。

バイアルには個別にバーコードのラベルが貼付されており、これをスキャンすることでサンプルのトレーサビリティを確保します。サンプルは、ロボット内の粉砕およびフォーマット用ロボットにロードされます。サンプルは自動的に粉砕・混合され、バイオマスを96ウェルプレートに分注することが可能になります。

バイアルに穴を開け、次にバイアルをロボットアームで再配置して、粉末を分注するための振動ホッパーの中にセットします。ホッパーの振動は天秤によって制御され、1ウェルあたりに分注される目標質量を達成します。バイオマスはプレートの10列に分注し、残りの2列を標準試料用として空けておきます。

1サンプルにつき4回繰り返し測定を行うことで、1プレートあたり20サンプルをロードします。このプレートの加水分解物をPCRプレートに3等分して分注し、3枚の光学プレートを作成します。これにより、バイオマスのウェルあたり3回の還元糖の定量が行われます。

フォーマット後、蒸発を防ぐためにプレートをシリコンマットで密封します。準備が整い次第、リキッドハンドリングロボットへ移送します。このリキッドハンドリングロボットにより、前処理、酵素加水分解、および遊離糖の定量が自動的に行われます。

2メートルのテーブルには、必要な各試薬の容器とプラスチックウェアの保管スペースが備わっています。前処理および加水分解用のインキュベーターと、糖定量用のサーマルサイクラーが設置されています。前処理はディープウェルプレートを用いて行います。

希釈した酸またはアルカリ溶液をバイオマス粉末に添加します。プレートをヒーティングブロックに移し、90 °Cで20分間インキュベートします。インキュベーション終了後、500 µLの酢酸バッファーで5回洗浄し、前処理液を除去します。

前処理後、洗浄を行い、酵素カクテルを添加します。これは標準的な混合液であり、セルラーゼとNovozyme 188を4:1の比率で含み、ウェルあたりの濃度は7 FPUとなります。

プレートを50 °Cで8時間、振盪しながらインキュベートします。得られた加水分解液75 µLをPCRプレートに移します。PCRプレートの11列目と12列目に、グルコース標準液を添加します。

次に、すべてのウェルに1 Mの水酸化ナトリウムを25 µLずつ加えます。最後に、PCRプレートにMBTH試薬を50 µLずつピペットで分注します。加水分解物を3枚目のPCRプレートに移し終えた後、ディープウェルプレートを保存します。

一方、PCRプレートをサーマルサイクラーに移し、60 °Cで15分間インキュベートします。プロセスの最終ステップは、呈色させるために反応混合液を光学プレートへ移すことです。インキュベーション後、PCRプレートをサーマルサイクラーから取り出します。

100 µLの酸化剤を転送した反応混合液に加えます。発色を促進させるため、リキッドハンドリングプロセスを24時間以内に4回行います。このうち、前処理のリンスと酵素の添加に約2時間、酵素による加水分解に8時間、そして糖の定量にさらに2時間を要します。

最初のプレートを8時間インキュベートしている間に、次のプレートの処理を開始します。このようにロボットのリソースを割り当てることで、1日あたり80サンプルの3スループットを実現し、放出される還元糖の量を測定します。光学プレートの測定波長は620 nmに設定されています。

得られた結果を解析し、放出された糖の量を、反応1時間あたりのミリグラムあたりのナノモルとして定量します。ご視聴ありがとうございました。本動画がバイオ燃料の研究の刺激になれば幸いです。