シトクロムを使用してミトコンドリア呼吸機能の可視化 Cオキシダーゼ/コハク酸脱水素酵素（COX / SDH）二重標識組織化学

この手順の全般的な目的は、新鮮凍結組織切片におけるミトコンドリア呼吸酵素欠損を直接的に視覚化することです。まず、目的の臓器からクライオスタット切片を採取します。次に、Cox組織化学染色を行い、続いてSDH組織化学染色を実施します。

最後に、組織切片を脱水し、封入してカバーガラスを掛けます。最終的に、細胞の青色染色の程度によって、ミトコンドリア機能不全の量を示すことができます。こんにちは。今日は、Cox-SDH二重標識組織化学的手法について解説します。

また、この手法はミトコンドリア疾患の研究に適用できるだけでなく、老化および加齢に伴う疾患への知見を得るためにも利用可能です。倫理的許可に従って安楽死させた動物から脳を取り出し、ドライアイスで迅速に凍結させます。凍結組織はアルミホイルで包み、切片を作成するまで-80°Cで保存してください。

脳をクライオスタットのチャックに載せ、埋没剤で囲むことで、組織を凍結切片作成に向けて準備します。速やかにチャックをクライオスタットに入れ、-21°Cで14 µmの切片を回収します。ヒーティングブロックを用いてスライド上で切片を融解させ、その後、室温で1時間、スライドを乾燥させます。

スライドを濡れた紙片を入れたスライド染色チャンバーに設置します。このアッセイでは反応時間が重要であるため、ケミカルフード内で1回につき最大10枚までのスライドを処理することを推奨します。PBSにdabおよびシトクロムCを含むインキュベーション用培地を調製し、ボルテックスで混合します。

2 µgのウシCDEを速やかに培地に加え、ボルテックスミキサーでよく混合します。CDEの粒子を完全に分散させるため、引き続きクリーンベンチ内で、各スライドに150〜200 µLのインキュベーション培地を加え、ピペットチップを用いて全領域に均一に広げます。スライドを37 °Cで40分間インキュベートします。

40分後、スライドからインキュベーション培地を除去します。PBSで10分間ずつ4回洗浄します。洗浄後、化学薬品用フード内で、濡らしたペーパーストリップを入れたスライド染色チャンバーにスライドを戻します。

PMSを遮光しながら、PBSでNBT溶液を調製します。溶液を素早くボルテックスし、ピペットチップを用いて各スライドに150から200 µLのNBT溶液を加え、すべての切片に均一に広げます。スライドを37 °Cで40分間インキュベートし、40分後、スライドから余分な溶液を取り除きます。PBSで1回10分間、計4回の洗浄を行います。

以下の濃度のエタノールに順次浸し、それぞれ2分間脱水する。70%、70%、95%、95%、および99.5%。最後に、さらに99.5%のエタノールで10分間処理する。スライドをキシレンに10分間浸し、LANで封入してカバーガラスをかける。

スライドを、換気の良い場所で一晩、または少なくとも1〜2時間乾燥させます。野生型および早老性のMT.DNA Mutatorマウスの脳切片を用いて、COXおよびSDH活性の連続標識を行いました。

野生型マウスの海馬では、濃褐色の染色によって示される正常なCox活性が認められます。MT DNA mutatorマウスの海馬では、12週および46週において、青色の染色で示されるCox欠損が認められました。M-T-D-N-A mutatorマウスでは、46週齢までにCox活性のさらなる低下が見られ、呼吸鎖機能不全の広範な悪化が示唆されました。

10分および25分という不十分なインキュベーション時間では、茶色のDAB反応産物の沈着が減少しました。インキュベーション時間が短縮されたことで、SDHインキュベーション中に青色のForan最終産物が形成され、COX欠損細胞が存在するように誤認される結果となりました。また、COXインキュベーション中のスライドのカバーガラス貼付も、DAB反応産物の不正確な形成および沈着を招きました。

CoxおよびSDH活性は、ここに示すように個別に標識することも可能ですが、連続標識はミトコンドリア機能不全を持つ細胞を特定する上で有用であることが証明されています。野生型マウスの脳におけるCOXおよびSDH活性の特異性コントロールの例では、陰性標識が示されています。したがって、Cox SCH二重標識で使用する化学薬品は極めて危険であるため、本アッセイを行う際は毎回、適切な実験着とマスクの着用、化学用ドラフトチャンバー内での作業、およびインキュベーション培地の適切な廃棄といった予防策を講じることを忘れないでください。