定量的免疫蛍光法を用いて腫瘍におけるタンパク質発現の不均一性のマッピング

本実験の全体的な目的は、ヒトがんの組織切片全体におけるバイオマーカーの発現量を正確に定量し、タンパク質発現の不均一性の度合いに数値値を割り当てることです。これは、まずホールスライド蛍光スキャナーを用いて、免疫蛍光染色されたがん組織切片をスキャンし、次に腫瘍内の評価対象となる関心領域（ROI）を選択することによって達成されます。

次に、aqua解析自動画像解析システムを用いて、浸潤腫瘍領域内における目的タンパク質の発現量を定量します。最終的に、この手法は癌組織におけるバイオマーカーの発現マッピングに利用でき、これは組織切片全体で非常に不均一である場合が多いものです。色彩および計量視覚化試薬を用いた免疫組織化学などの従来法と比較して、これらの手法を用いる主な利点は、免疫蛍光法の方が定量性が高く、感度に優れている点にあります。

これらの分析手法を組織切片全体での免疫蛍光スキャニングと組み合わせることで、組織全体におけるバイオマーカー発現のわずかな変動を詳細にマッピングすることが可能になります。ここでは、Histo RXラボのオペレーション・ディレクターであるMark Gustafsonが、これらの手順を初めて実演します。がん組織生検サンプルのミクロトームによる切片作成と、目的のバイオマーカーの発現に関する標本の免疫蛍光染色を行った後、染色済み切片を貼付したスライドを最大5枚までスライドスキャナーのスライドカセットにセットしてください。

次に、ScanScopeコンソールのインターフェースを使用します。各スライドについて、染色パターンやサンプルのその他の観察可能な外観に関わらず、スライド上のすべての組織が含まれるように領域を選択します。続いて、ScanScopeコンソールを使用して、最適な代表領域を確保するため、理想的には組織の腫瘍領域内から評価する組織領域を選択します。

次に、スキャンスコープコンソールの自動露出機能を使用して、各チャンネルの露出時間と画像のフォーカスを決定します。スキャンスコープコンソールの画像上にある青いダイヤモンドを使用して、組織から離れた、かつカバーガラス内のスライド領域内にある別の領域を選択し、フラットフィールド補正画像の取得に使用する背景領域を定義します。各フィルターについて、画像キャプチャを最適化するために、黄色の正方形で示されるフォーカスポイントを組織領域に追加します。画像に高い背景ノイズやその他のアーティファクトが見られる場合は、画像領域を移動して新しい画像を取得する必要があります。

次に組織をスキャンし、取得したデジタルスライド画像をAperio spectrumデータベースに自動的にアップロードします。spectrumプログラムのサムネイル画像をダブルクリックし、spectrumデータベースのデジタルスライドリストから解析対象のスライドを選択します。その後、付属のH&E染色注釈付き画像を用いて、蛍光画像上の関心領域に注釈を付けます。

個別の円で囲まれた複数の関心領域を、単一のサンプル上で選択できます。アノテーション付きの画像は、スペクトラムデータベースに自動的に保存されます。次に、画面上部のメニューバーからAnalyzeを選択し、解析ウィンドウが表示されたら、プルダウンメニューからhisto RX aqua analysisを選択してください。

準備が整ったら、「analyze」ボタンを押してください。Windowsタスクバーに最小化されたコンソールウィンドウが表示され、Spectrumデータベースからローカルコンピュータへの画像転送の進捗状況が表示されます。データの転送が完了すると、aqua analysisが起動し、サンプルの一次しきい値（背景画像信号を超えるパンサイトケラチン画像信号）のデータクラスタリングに基づく教師なしaquaスコアリングアルゴリズムを用いて、aquaスコアを生成します。これにより、ピクセルを用いて腫瘍マスクを定義することができ、その後の計算に使用することが可能になります。

高発現のパンサイトケラチン画素を使用して、腫瘍細胞の細胞質または非核領域を定義します。ここで示されているように、腫瘍マスク内にあるDPIチャンネルで強い信号を示す画素は、核であると識別されます。レビューの結果、検体または撮像上のアーティファクトによりスコアリングに適さない視野が特定された場合、それらの視野はスコアリングから除外され、最終結果は判定不能（fail）となります。

aquaスコアリングの結果は、組織切片サンプル全体の関心領域内にある各512×512ピクセルのタイルに関連付けられたスコアのテーブルとして表され、これを保存してその後の統計解析に使用することができます。これらのヘマトキシリン・エオジン染色による顕微鏡写真は、同一の卵巣癌であっても領域によって形態が異なることを示しています。図Bの右上にある高倍率像では、腫瘍の上部において細胞質の淡染と充実性増殖パターンを示す細胞が強調されています。

しかしながら、図Cの右下部分で拡大されている組織の下部は、より均一な好酸性細胞質と乳頭状増殖パターンを示しています。ここでは、化学療法治療前後の卵巣癌組織切片におけるER発現の不均一性ヒートマップを、それぞれ上段と下段のパネルに示しています。上図では切片全体でER発現にばらつきがあり、高発現領域と低発現領域の両方が見られますが、下図では赤色で示される高いER発現が均一に分布しているという変化に注目してください。

この変化の数値的表現は、左側に示されているSimpson指数の減少によって表されています。この図では、卵巣がんの組織切片におけるHER2の不均一性ヒートマップを、治療前（上段）と治療後（下段）にそれぞれ再び示しています。上図では切片全体でHER2の発現にばらつきがあり、高発現領域と低発現領域の両方が見られますが、下図ではHER2の高発現が均一に分布しているという変化に改めて注目してください。

ここでも、シンプソン指数が減少していることが分かります。この手順を行う際は、計算解析によって生成されるデータの質は染色の質に依存するため、染色を高い技術水準で実施することが重要であるという点に注意してください。