虚血性創傷モデルを作製するための簡略化手法

本実験の総合的な目的は、正常なウサギだけでなく、高齢や糖尿病など抵抗力が低下したウサギにおいても、虚血性創傷を作成することを可能にすることである。現在用いられている虚血性創傷作成の手法はすべて侵襲性が高く、これまで糖尿病動物に適用できる手法は存在しなかった。本手順では、3つの血管束の上に3箇所の小さな皮膚切開を行うことから始まる、低侵襲手術を用いる。

次のステップでは、耳への血流を減少させつつ、完全に遮断しないように、中心静脈と耳介血管束を単離して保護します。最後に、皮膚切開部位を通じて、残りの血管、神経、および皮下組織をすべて切断または結紮します。耳の虚血は、動脈拍動の消失、耳の外観、温度差、および皮下酸素飽和度によって確認します。

この低侵襲手術は実施が困難であるように思われるかもしれませんが、実際には非常に簡単です。この手法の主な利点は、皮膚への侵襲が非常に少ないことです。2007年にこの手法を初めて発表して以来、多くの問い合わせをいただいています。

その後、私たちはこの手順をさらに簡略化しました。顕微鏡を使用せずにさらに容易に実施できるようにするため、まず選択したウサギの体重を測定し、ケタミンとキシラジンの混合物を用いてウサギを麻酔します。ウサギのバイタルサインをモニタリングすると、背面で耳に供給される3つの血管束を確認することができます。

これらは、他の血管へと繋がる側枝を持つ最大の束である中心束（central bundle）、通常は動脈が非常に小さいか欠損している側束（coddle bundle）、および頭側束（cranial bundle）です。腹側では、遠位の皮膚は近位の血管から血流を受け取っていません。

代わりに、耳背面の血管束は軟骨を貫通する多数の分枝を持ち、これらが遠位腹側皮膚に血液を供給しています。一部のウサギでは、腹側にも非常に小さな皮下血管が存在しますが、これは腹側皮膚の3分の1以下にのみ血液を供給しています。したがって、全周性の皮膚切開を行う際、腹側の切開部位からは実質的に出血が認められません。

次に進む前に、足指のつまみ刺激と眼反射を用いて、ウサギが痛み刺激に反応しないことを確認し、人工涙液点眼薬を塗布して動物の目を保護します。手術中はヒートパッドを用いてウサギを保温してください。その後、ベタディンとアルコールを用いて両耳および周囲の皮膚を洗浄し、両耳のみが露出するようにウサギをドレーピングします。

片方の耳を虚血状態にし、もう片方を対照群として使用します。手術に使用する器具は、15番メス刃を備えた外科用ナイフ、皮膚用とその他の軟部組織用のピックアップ2組、蚊鉗子3本、曲がりマイクロ鋏1〜2組、縫合糸および強靭な組織の切断用小型鋏1組、持針器、およびステンレス製パンチ数本です。

動脈と静脈に基づいて3つの血管茎を特定し、手術を開始します。15番メスを用い、中央の血管茎上で皮膚を垂直に1回慎重に切開します。

中心静脈を周囲組織から分離して保護します。この手順により、牽引するための中心静脈の周囲を囲みます。

中心神経を遊離させます。通常、この神経は静脈の側面に位置しています。ハサミを用いて神経を切断します。

中心動脈を慎重に剥離します。通常、動脈は静脈よりも頭側にあり、より深層に位置しています。動脈を結紮し、切断します。耳軟骨上の中心静脈周囲の組織を清掃します。

次に、coddle pedicleの上に2回目の皮膚切開を加えます。神経血管束を温存するため、血管を剥離し、保護のために結紮します。

このウサギのように静脈が大きい場合に特に有用です。ここから最初の切開口までの間にトンネルを作成します。軟骨上の皮下組織を切除します。

頭蓋神経束の上に3番目の皮膚切開を加えます。この神経束全体を結紮して分離します。3番目の神経束上の皮膚を切開します。

この静脈は皮膚に非常に近いため、深く切りすぎないようにしてください。その後、血管束全体を剥離し、結紮して分離します。ナイフとハサミを使用して、皮下トンネルを作成します。

3か所の切開により、すべての皮下組織、筋肉、神経、および微小血管分枝を切断します。さらに鋭的および鈍的剥離を行い、底部を清掃し、幅約5〜10 mmの軟骨を露出させます。出血はガーゼによる圧迫で制御可能です。

電気焼灼は不要です。耳内部の皮膚は血流が少ないため、切開しません。この手技において重要な点は、血管を保護しながら皮下トンネルを十分に剥離することです。

この手順はそれほど困難ではないはずです。止血後、3か所の皮膚切開部を4-0または5-0の縫合糸で閉鎖し、切開部が適切に閉じられ、出血が見られないことを再度確認します。創傷治癒薬の試験を行う場合は、6 mmのステンレス製パンチを用いて、各耳の腹側に4か所の円形全層皮膚創を作成することができます。

創傷間の距離は少なくとも20～30 mmとします。パンチ内部の皮膚および軟骨膜を除去しますが、軟骨を損傷させないように注意してください。両耳に創傷を作成した後、一時的にガーゼで覆い、薬剤投与のためウサギを処置室へ移動させます。

創傷部位から血栓を除去し、試験薬および対照薬を塗布します。乾燥を防ぐため、創傷部位を密封ドレッシング材で被覆します。2種類の薬剤を比較する場合は、各薬剤を近位および遠位の両方の創傷部位に塗布してください。

これにより、術後の耳の遠位側と近位側における創傷治癒速度の差を制御します。虚血状態の耳は通常、切開部位より遠位で温度が低下し、チアノーゼが現れ、感覚が鈍くなります。軽い浮腫が数日間見られることがありますが、自然に消失するため、治療の必要はありません。

中心動脈の拍動は消失しています。耳の基部にいくつかの筋肉がまだ付着しているため、耳の動きは減少していますが、完全に消失しているわけではありません。トンネルが正しく作成されていれば、切開線の間に明確な窪みが確認できます。

術後の痛みを緩和するため、フェンタニルパッチを背中の皮膚に貼付します。体温計を用いて、毎日両耳の皮膚温度を測定します。経皮的酸素分圧計またはレーザードップラー血流計を用いて、耳の血流を測定します。

1週間後、皮膚切開部の縫合糸を抜去できます（2007年）。この手順は70匹以上のウサギに使用されており、これには糖尿病のウサギ23匹と高齢のウサギ4匹が含まれています。

非虚血耳と虚血耳の温度差は1～10 °Cの範囲であり、ほとんどのウサギで2～6 °Cの範囲内であった。温度差は術後早期に高く、15日目以降に徐々に減少したが、1ヶ月の終了時点でも依然として維持されていた。各耳から6つの組織サンプルを採取し、HPLCを用いて高エネルギーリン酸含有量（TPおよび総エネルギーの両方）を測定した。

濃度は、虚血耳よりも正常耳で高くなっていました。非糖尿病および糖尿病動物における15匹の非糖尿病ウサギにおいて、創傷治癒時間は非虚血耳よりも虚血耳で常に長くなりました。平均治癒時間は、非虚血耳で17.8日であったのに対し、虚血耳では21.8日でした。

10〜12ヶ月の糖尿病動物において、平均治癒期間は非虚血耳では18.3日であったのに対し、虚血耳では29.1日でした。糖尿病ラビットを含むすべての動物において、皮膚切開創は合併症なく正常に治癒しました。糖尿病期間が24ヶ月になると、腹側創は感染しやすくなる傾向があります。

この特徴により、ヒトの糖尿病性創傷により近い状態となります。組織学的なサンプルでは、筋肉が消失し線維組織に置き換わった皮下トンネルの治癒が示されています。しかし、皮膚は無傷です。

この手順を行う際は、動物を人道的に扱うことが重要です。習熟すれば、この手技は1時間以内に完了させることができます。私たちはこの手法を70匹以上のウサギ（うち23匹の糖尿病ウサギを含む）に使用しましたが、出血や感染などの合併症は認められませんでした。

本手順に従えば、非常に安全に実施することが可能です。血管性潰瘍、圧迫潰瘍、糖尿病性神経障害などのさらなる疑問を解消するために、追加の虚血、神経損傷、細菌接種などの他の手法を併用することができます。