ラットの坐骨神経と疼痛過敏テストの慢性的なくびれ

本手順の全体的な目的は、神経障害性疼痛の一般的なげっ歯類モデルである坐骨神経の慢性絞扼損傷を行い、その結果生じる疼痛行動を定量的に測定することです。まず、大腿中部レベルで露出させた坐骨神経の周囲に4本のクロミックガット結紮糸を配置し、坐骨神経に絞扼損傷を誘発します。次に、von Freyエステジア（von Frey aesthesia）を用いて機械刺激に対する足底引込閾値を、またプランターアナルゲジアメーター（plantar analgesia meter）を用いて熱刺激に対する足底引込潜時を定量的に測定することで、任意の時点における後肢の疼痛行動をモニタリングします。

最終的に、機械的および熱的刺激に対する誘発性逃避反応の測定を通じて、機械的および熱的な痛み、ならびに損傷した後肢の過敏症の存在を示す結果を得ることができます。beneおよびZによって最初に開発されたこの末梢神経損傷法は、ニューロパチー性疼痛が生成される末梢および中枢のメカニズムは何かという、慢性疼痛分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。このモデルは疼痛過敏を軽減するための新しい戦略を検討する基礎となるため、この手法の意義はニューロパチー性疼痛の治療にまで及びます。

一般的に、この手法に不慣れな方は、静止神経の周囲にcmic腸縫合糸を配置することや、過剰にならない範囲で十分な神経損傷を引き起こす適切な締め付け加減を調整することに特に苦労します。本手順を開始するには、まず手術作業面を70% ethanolで消毒し、あらかじめオートクレーブ滅菌した滅菌器具、ガーゼ、ステープラー、および綿球を準備します。次に、導入チャンバー内で5% ISO fluorineを用いてラットを麻酔します。

手術中、特製のフェイスマスクを通じて2%ISOフルエンを投与します。その後、ラットの左後肢を剃毛し、動物を37 °Cに設定された温度調節可能な加熱マットの上に置きます。目に眼科用潤滑剤を塗布します。

次に、クロミックキャットガット縫合糸を約3 cmの短い断片に切り、滅菌生理食塩水に浸して準備します。続いて、除毛した部位をアルコールとヨウ素溶液で交互に3回洗浄し、滅菌します。動物を胸部を下にして伏せさせ、左後肢を挙上させ、足にマスキングテープを貼って大腿骨を脊椎に対して90度の角度に固定します。

次に、大腿骨の約3〜4 mm下で皮膚を切開します。結合組織を切断して、切開部位周辺の皮膚を筋肉から剥離します。鈍端剪刀を用いて、大臀筋（gluteus superficialis）と大腿二頭筋（biceps fems muscles）の間の結合組織を切断します。

次に、リトラクターを使用して2つの筋肉の間の間隔を広げ、坐骨神経を明確に視認できるようにします。その後、ピンセットとマイクロシザーを用いて、坐骨神経の約10 mmを周囲の結合組織から慎重に剥離します。各結紮について、坐骨神経の三分岐部の近位側に最初の結紮糸を縛ります。まずは1つの緩いループから始めてください。

次に、ループに近い両端を掴み、ループがちょうど密着し、結紮糸が神経に沿って滑らない程度まで引きます。その後、ループを適切な位置に保持し、1つ目のループの上に2つ目のループを重ねて結び目を完成させます。次に、結紮糸の緩い端を切り、神経の絞り込みが1 mm程度の円形となり、最小限に留まるようにします。

残りの3本の結紮についても同様の手順を繰り返し、 each additional ligatureを前回の結紮部位よりも1 mm近位に結んでいきます。手術の最後に、最小限の絞り込みを行いながら、縫合糸で筋層を閉鎖し、ステープラーで皮膚を固定します。次に、ヨード溶液を用いて創部を滅菌します。

麻酔からの回復期は動物を注意深く観察し、平らなペーパーベディングを敷いた別のケージで回復させてください。実験を開始する前に、数日間にわたって毎日動物をハンドリングしてください。

次に、行動試験の前に、ラットをケージ内で馴化させます。試験環境は静穏で、温度と湿度が一定に制御された状態を維持し、各試験セッションは1日のうち同様の時間帯に行う必要があります。試験当日に機械的逃避閾値を測定するには、実験の15〜30分前にラットを高床メッシュ床の試験ケージに入れます。ダイナミック・プランター・フォンフレイ装置を用い、タッチスティミュレーターユニットのフィラメントを後足の足底中央の直下に配置し、スタートキーを押してください。

これによりフィラメントが持ち上がり、後足の足底面に段階的に強くなる力で機械的刺激を与えます。次に、損傷した後足と未損傷の後足の両方から機械的逃避閾値を記録します。この装置は、逃避反応時に加えられた最大値を自動的に記録し、表示します。

機械的刺激を、刺激間隔を約5分として3回繰り返し、非損傷側の後肢とカウンターバランスさせた順序で試験し、その後、足底逃避閾値の平均値を算出します。試験当日の熱逃避潜時を調べるために、実験の15～30分前にラットをガラス底の試験ケージに入れます。サーマルプランター鎮痛測定器を用い、赤外線光源を後肢の足底中央の直下に配置し、スタートキーを押します。

これにより、後肢の足底面が透明なガラス面を介して輻射熱ビームにさらされます。次に、損傷した後肢と非損傷の後肢の両方から逃避潜時を記録します。この装置は、熱刺激の開始から熱源から足を離すまでの時間を自動的に記録します。

熱刺激を少なくとも3回繰り返し、刺激の間隔は約5分として、損傷した後肢と損傷していない後肢をカウンターバランス順にテストし、その後、後肢の逃避潜時の平均値を算出します。ここでは、坐骨神経の慢性絞扼後、0日から12日までのWistarラットの損傷および非損傷後肢における機械的逃避閾値を示しています。非損傷側の対側後肢と比較して、損傷した同側後肢では、機械刺激に対する逃避閾値が有意に低下しています。ここでは、坐骨神経の慢性絞扼後、0日から12日までの損傷および非損傷後肢における熱逃避潜時を示しています。

同様に、熱刺激に対する逃避潜時は、非負傷側の対照側後肢と比較して、損傷した同側後肢において有意に短縮します。CCI手術に習熟すれば、1匹あたりわずか20分で適切に実施でき、後肢に長期的な疼痛過敏状態を誘発させることが可能です。この処置を行う際は、結紮を緩めに結ぶことが重要です。なぜなら、浮腫の発生後に結紮部の下で自己絞扼が起こり、それによって血管などの収縮が生じるためです。

この末梢神経損傷法と痛覚過敏P波の測定を組み合わせた手法は、神経損傷による慢性疼痛のメカニズムを解明しようとする神経障害性疼痛分野の研究者に有用です。