の定量的比較シス -調節エレメント（CRE）の活動キイロショウジョウバエ

この手順の全体的な目的は、キイロショウジョウバエの変態過程で活性化するCIS調節エレメントまたはCREの遺伝子調節活性を定量的に測定することです。まず、部位特異的組み込み法を用いて、リポーター導入遺伝子としてCREを導入したトランスジェニック系統を作製します。次に、実体顕微鏡を用いて、適切な発生段階にあるトランスジェニック個体を取得します。

検体を外側のピューブから取り出し、ガラス製顕微鏡スライドに固定します。共焦点顕微鏡解析により、ホールマウントサンプルの蛍光レポータータンパク質発現のレベルとパターンを記録します。最後に、Image Jソフトウェアツールを使用して、記録した共焦点画像の蛍光レポータータンパク質発現レベルを定量化します。

これらの結果により、遺伝子制御活性のレベルが割り当てられ、制御エレメントの補助および、修飾されたCREバージョンのさらなる比較遺伝子発現研究が促進されます。この手順は、遺伝子制御およびその遺伝子制御がどのようにコードされているかに関心を持つ、重要な疑問への回答に役立ちます。DNAは、発生生物学および進化生物学に関連しています。

この手順は、キイロショウジョウバエ（drosophila melanogaster）の変態過程で機能するシス制御エレメントに関する知見を得るために開発されました。しかし、原理的には、他の発生段階や他のショウジョウバエ種、さらには他のモデル生物で機能するシス制御エレメントにも適用可能です。トランスジェニック系統を拡大するために、オスとメスのハエを数匹ずつ入れたバイアルを、日をずらして2つ用意します。

ショウジョウバエを1つのバイアルから新しいバイアルに移動させます。これを1週間繰り返します。2週間後までに、トランスジェニックショウジョウバエが幼虫期から成虫期までのあらゆる発生段階にわたっていることを確認してください。

ERが形成される3齢幼虫期の終わりに、検体のステージングを開始します。検体が非移動性であることに注意してください。ERが柔らかい白色になり、球状体が消失した時点で、このタイムポイントとして指定します。

0 HAPFにて。体の中心付近に左右対称に位置する生殖腺の有無で、オスとメスを区別します。生殖腺は半透明の円状に見え、その大きさに基づいて変態の段階を判定します。0 HAPFに、湿らせた筆を用いて個体を新しいバイアルに移します。

キムワイプを1枚加え、水で湿らせて検体が乾燥するのを防ぎます。次に、目的のHAPFに達するまで、バイアルを25 °Cでインキュベートします。あるいは、付属のテキストに詳述されているいくつかの形態学的マーカーの有無と位置に基づいた同定により、検体のステージ分けを行ってください。

ラボテープを使用して、粘着面を上にして梱包用テープを解剖ボードに貼り付けます。絵筆を濡らし、絵筆を用いて標本に水分を補給します。標本をKimwipeに移動させます。

標本を梱包用テープに移し、背面を上にして貼り付けます。標本を15分間乾燥させます。ピンセットを用いて、ERを徐々に開いていきます。

前端またはpermから開始し、後端に向かって進めます。次に、puiを顕微鏡スライド上の高粘度オイルの一滴に転移させ、ホールマウント標本として顕微鏡で標本を評価します。4xまたは10xの対物レンズを使用して、標本に焦点を合わせます。

共焦点顕微鏡のソフトウェアを使用して、光退色を防ぐために目的の蛍光タンパク質に応じた励起波長を調整します。レーザー強度はまず5〜10%から開始してください。信号が不十分な場合は、信号対雑音比（S/N比）を向上させるため、必要に応じて強度を上げます。共焦点画像については、CRE活性の定量的な比較を行うため、カルマン平均化など、繰り返しスキャンによるピクセル測定値を平均化するソフトウェア設定を有効にし、蛍光が最も強く現れるCセクションを使用します。

飽和警告ルックアップテーブルに切り替え、飽和するピクセルが少なくなるところまでチャネルの電圧ゲインとオフセットを調整します。必要に応じて、共焦点アパチャを調整してください。最適な設定が決定したら、ZSスキャンを実行し、Z軸に沿った一連の画像を取得します。

スキャン完了後、画像のスタックを投影図に変換し、この画像ファイルをTIF形式で保存します。CRE活性の定量比較を行う際は、すべての反復試料およびレポーター導入遺伝子ラインに対して、同一の共焦点顕微鏡設定を使用してください。Image Jプログラムを用いた解析では、評価対象のTIFF画像を開いて開始します。

フリーハンド選択ボタンをクリックし、定量化したい標本の領域を囲みます。ピクセル値の統計量を得るには、「analyze」タブをクリックし、「measure」を選択してください。結果ボックスに表示された平均ピクセル値のスコアを記録します。

また、CREが活性化していない背景領域から2つ目の平均ピクセル値を収集します。補正平均ピクセル値を導出するために、繰り返し標本についてピクセル値の統計量を生成し続けます。次に、複製標本の補正平均ピクセル値から、CREの平均調節活性を決定し、平均値の標準誤差を算出します。

本実験では、ホワイトレスキュー眼表現型の強度を用いて、トランスジェニック系統をホモ接合体にします。部位特異的な外来遺伝子の組み込みには、A TTP ランディングサイト配列を持つ white 遺伝子変異体の遺伝的背景を利用します。組み込まれたベクターのヘミ接合体およびホモ接合体であるトランスジェニック個体は、組み込まれた mini white 遺伝子のコピー数による、レスキューされた眼色の表現型の強度によって区別されます。

次に、最も暗い眼色の表現型を持つ雄と雌のハエを交配させ、ホモ接合体系統を確立します。形態学的マーカーは、ショウジョウバエが幼虫から成虫へと変態する際の方変態段階を決定するために用いられます。個体は一連の定型的な形態変化を経て移行するため、それらを用いて性別を判定し、発生段階を概算することができます。ここに従います。

dimorphic elementと呼ばれるCREの野生型バージョンは、メスのpuyのASIC腹部節において高レベルのEGFPレポーター発現を誘導します。このCRE内の13塩基対の配列がDSX転写因子の結合部位であることが判明しており、この結合部位を変異させた際のCREの調節活性を定量化することで、この配列のin vivoにおける重要性が実証されます。定量分析の結果、ここで用いたトランスジェニック挿入部位において、このDSX部位の変異により調節活性が野生型発現の28 ± 3%まで低下することが示されました。

同様の比較により、種内CREアレル間、あるいは異なる種の同源CRE間の調節活性を評価することができ、例えば、雌の体節におけるEGFPレベルと比較します。D. melanogaster gastric Canin S株によって駆動された、D. stimulantsおよびD. williの種の同源CREの調節活性は、それぞれ75 ± 4%および0 ± 0%でした。RNA干渉のような後続の手法を転写因子遺伝子に用いることで、これらの転写因子遺伝子がどのようにCIS調節エレメントと相互作用するかという追加の疑問に答えることができます。

これは、CIS調節エレメントによって駆動される蛍光リポータータンパク質の発現量が増減することで示されます。この手順により、遺伝子調節分野の研究者が、cis調節エレメントのモチーフおよび進化した変異が遺伝子発現に及ぼす機能的重要性を探索する道が開かれました。