FRETはレシオメトリックで細胞周期のキナーゼおよびホスファターゼの活動を監視

このビデオでは、Förster共鳴エネルギー移動（FRET）を用いて、細胞周期全体におけるキナーゼおよびホスファターゼ活性をモニタリングします。ここでは、Polo-like kinase 1（PLK1）活性プローブの一端にシアン蛍光タンパク質（CFP）を、もう一端にイエロー蛍光タンパク質（YFP）を配置しています。このプローブをU2 OS細胞にトランスフェクションします。

次に、G2/M期移行におけるLckターゲットのリン酸化状態を調べるため、トランスフェクションしたU2 OS細胞に対してタイムラプス蛍光イメージングを行います。CFPとYFPが近接しており、かつCFPが励起されると、エネルギーがYFPに転移し、YFPの放出が検出されます。しかし、プローブがリン酸化されると、タンパク質の構造変化が起こり、CFPとYFPが離れます。

CFPが励起されると、強いCFP発光とわずかなYFP発光のみが検出されます。CFPおよびYFPの両方を励起させた後のYFP発光比を定量化することで、PLK1の活性がG2期に上昇し、有糸分裂中にピークに達することが示されます。したがって、標準的なタイムラプス撮影などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、撮影条件やプローブの発現によって細胞周期が乱されないことに特に配慮している点にあります。本手法は、特定のキナーゼやホスファターゼがいつ、どこで活性化されるかといった、細胞周期分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。

この手法は細胞周期調節酵素に関する知見を得るために有用であるだけでなく、細胞増殖アッセイなど、非共役条件が必要とされる他のシステムにも適用可能です。ヒトの細胞周期をモニタリングするため、U2 OS細胞にFRETベースのPK1活性プローブをトランスフェクションします。標準的なリン酸カルシウム法を用いてトランスフェクションを行い、ピューマイシンで少なくとも7日間選択します。

これにより、プローブを発現している細胞集団を濃縮し、毒性のある発現レベルや細胞周期に深刻な影響を及ぼす発現レベルを持つ細胞数を制限します。次に、限界希釈法によりCFPを発現する安定クローンを選別し、YFPの発現を確認して、すべての細胞でほぼ同じ比率で存在しているかを検証します。一部の細胞にCFPまたはYFPのみが含まれている場合は、組換えが起こった可能性が高いため、Sure 2 cellsなどの相同組換えが起こりにくい細菌を用いてプラスミド調製をやり直し、その後プラスミドを線状化してトランスフェクションを繰り返してください。

プローブを安定的に発現させた細胞を、接着後、コンフルエンシーが 30% から 50% に達した時点で、No. 1.5 のガラスボトムディッシュに播種します。培地を CO2 独立型でフェノールレッドを含まないものに交換し、温度制御を 37 °C に設定した電動エピ蛍光顕微鏡に細胞をセットします。顕微鏡には CFP および YFP の励起・蛍光フィルターが装着されている必要があります。

CFPおよびYFPのモニタリングに適したROICミラーと、必要とされる解像度に適した対物レンズを用意します。ここでは、20 x NA 0.75の空気対物レンズを使用しています。透過光を用いて、細胞に焦点を合わせます。

この時点で蛍光光を用いると、細胞周期を乱す可能性のあるストレス応答が誘導されるため、使用しないでください。光毒性を避けるため、必要な細胞内解像度を維持できる範囲で、屈折率を最大に設定します。本実験では、核と細胞質を区別できれば十分です。

露光時間を短く設定し、高濃度ニュートラル密度フィルターを挿入します。次に、YFPの励起および蛍光波長を用いて12ビットまたは16ビットのテスト画像を撮像します。細胞内の平均強度が、背景強度に「背景強度の最小値と最大値の差の5倍」を加えた値とおよそ等しくなるように、露光時間とニュートラル密度フィルターを調整します。画像が飽和していないことを確認するため、サンプル画像の蛍光強度を検証してください。

細胞が有糸分裂に入った際の強度変化を許容するため、画像内の最大強度はダイナミックレンジの半分未満にする必要があります。次に、CFP励起フィルタとYFP蛍光フィルタを用いてこのプロセスを繰り返します。フォーカシングおよび露光条件の最適化に使用した領域を除き、トランスフェクションされた細胞が含まれる複数の領域を選択してください。

これらの手順によってストレス応答が誘発された可能性があるため、すべての細胞において最大強度がダイナミックレンジの半分未満であることを確認してください。ソフトウェアを用いて、YFP励起、YFP蛍光、およびCFP励起を用いて45分ごとに2枚の画像を撮影するように設定します。YFP蛍光フィルターを使用してください。

また、実験の総時間を細胞周期の期間より長く設定してください。すべての設定が完了したら、画像の取得を開始します。取得が完了した後、取得した画像を開き、有糸分裂から次の有糸分裂までの細胞周期時間をモニタリングします。ここでトランスフェクションされたプローブを発現している細胞の場合、細胞周期時間は概ね 20 to 25 hours でした。

これを、使用した細胞種のコントロールデータと比較します。細胞周期の時間が参照タイミングと一致していれば、FRET解析が可能です。タイミングが確認された後、画像の解析を行うことができます。

解析は、ほとんどの顕微鏡専用ソフトウェアで実行可能です。ここでは、フリーウェアのImage Jとratio plusプラグインを使用します。まず、Image Jで画像を開き、解析を開始します。画像がマルチカラースタック形式である場合は、Imageメニューからハイパースタックに変換して、個々のチャンネルを分離してください。

次に、「Hyperstack」から「Stack to Hyperstack」を選択します。「Convert to Hyperstack」ウィンドウが表示され、設定画面が開くので、「OK」をクリックします。これで、画像の下に2本のスライダーバーが表示されます。

次に、画像をシングルチャンネルスタックに分割するため、画像をクリックし、「Hyperstack Reduce Dimensionality」を選択します。これによりリデュースウィンドウが開きますので、「Frames」と「Keep Source」が選択されていることを確認し、「OK」をクリックします。

1つのチャンネルのみを含む新しい画像が表示されます。この操作を繰り返し、2番目のチャンネルを含む新しい画像を表示させます。次に、最終的な画像の視覚的な明瞭度を上げるため、YFP excitation YFP emission stackを選択します。

「process」をクリックし、次に「math」をクリックします。その後、「multiply」を選択してください。「multiply」ウィンドウが開いたら、「3」を入力して、YFP excitation YFP emissionスタックを3倍にします。このステップは任意ですが、これにより比率が0から1の範囲に収まるのを防ぐことができます。

次に、Image Jツールバーでフリーハンドツールを選択します。続いて、YFP励起・YFP蛍光スタックにおいて、細胞が存在しないが測定対象の細胞に近い領域に、関心領域（ROI）を描画します。ROIマネージャーにROIを追加するため、「Analyze」ツールをクリックし、「ROI Manager」を選択します。

ROIマネージャーウィンドウが表示されます。[add]をクリックしてROI座標を保存し、YFP励起YFP蛍光スタックにおけるROIの平均強度を測定します。[analyze]をクリックし、[measure]を選択します。

結果ウィンドウが開きます。CFP励起YFP蛍光のスタックを選択してください。次に、ROIマネージャー内のROIをダブルクリックし、測定を繰り返します。

測定値が結果ウィンドウに追加されます。スタック内の他の箇所にスクロールし、複数のタイムポイントでこのプロセスを繰り返します。結果ウィンドウの測定値を比較して、目的の細胞付近の背景強度がフィルム全体で同様であることを確認してください。

最小強度を測定に含めるには、[analyze]をクリックし、次に[set measurements]をクリックして、グレー値の最小値と最大値を指定します。次に、測定オプションを表示するウィンドウが表示されます。必要に応じて明るさとコントラストを調整した後、細胞の大部分を覆うようにROIを描き、両方のスタックで最小強度を測定します。

次に、今度はバックグラウンドの代わりに細胞を用いて、前と同様に測定を行います。結果セクションの値を用いて、測定された最小強度とバックグラウンド強度の差を算出し、それを2で割ります。これにより、clipping value to open ratioプラス選択したプラグインのための初期推定値が得られます。

次に、「ratio plus」を選択します。FRET比について、CFP励起YFP蛍光のS stack 1を選択するか、あるいはリン酸化に伴いFRET効率が低下するプローブを可視化する反転FRET比の場合は、YFP励起YFP蛍光のS stack 1を選択して、測定した背景強度とクリッピング値を挿入します。

結果ウィンドウの値を使用し、それを ratio plus ウィンドウに貼り付けます。得られたレシオスタックのスケーリングを設定し、適切なルックアップテーブルを適用してレシオの変化を可視化します。PLK1活性をモニタリングするFRETベースのプローブを発現させたU2 OS細胞を、本ビデオで説明した通り60時間にわたって撮影しました。

この画像は、娘細胞の分裂を含む、fretプローブを発現している50個の細胞における累積的な有糸分裂進入を示しています。プローブを発現している細胞の大部分は20から25時間の細胞周期で増殖しており、このことは、イメージング条件およびプローブの発現レベルが細胞周期のタイミングに影響を与えていないことを示しています。1個の細胞の4回の分裂を追跡した反転fret比の擬似カラー表示では、かなりのノイズはあるものの、PK oneの活性がG2期に上昇し、有糸分裂中にピークに達するという傾向が見られます。

生データを平均化フィルタリングしてグラフとして提示すると、活性ピーク間の時間を容易に推定することができます。この図は、前の画像に示された細胞の逆FRET比の定量化をグラフで示したものです。活性化のタイミングを推定することができ、ここで見られるように、プローブのリン酸化は、有糸分裂においてリン酸化がピークに達する約4時間前から視認できるようになります。

本手順を行う際は、細胞にストレスを与えない状態に保つことが重要であるため、光への曝露を最小限に抑え、温度やpHの変化を最小限に留めるようにする。また、本手法は細胞内におけるキナーゼ活性とホスファターゼ活性のバランスをモニタリングするものであることを念頭に置く必要がある。本手順は、RNA干渉や阻害剤スクリーニングと組み合わせることで、これらのキナーゼおよびホスファターゼの上流調節因子を特定することが可能である。