監視劈開カスパーゼ-3活性およびカリウム誘発性膜の脱分極に続いてライブセルイメージングとCleaveable蛍光色素基質を用いて不死化オリゴデンドログリア細胞のアポトーシス

本手順では、オリゴ DDR グリア細胞の死をリアルタイムでモニタリングすることができます。まず細胞を培養し、次にライブセルイメージングのための準備を行います。その後、細胞に処理を施し、蛍光顕微鏡を用いてその影響をモニタリングします。

最終ステップはデータ解析の実施です。最終的に、カスパーゼ活性化蛍光染料による核の蛍光をモニタリングすることで、処置または刺激後の細胞集団における細胞死率が示されます。免疫染色などの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、複数のタイムポイントを同時に収集できることです。

この手法は、薬理学的処置、試薬、およびさまざまな処理に対する応答など、細胞生物学における重要な疑問を解決するのに役立ちます。また、本手法を用いることで、細胞培養内における細胞死に関する知見を得ることが可能です。さらに、ex vivoや脳スライスを含む器官培養組織などの他の系にも適用できます。

一般的に、この手法に慣れていない方は、固定組織ではなく生体組織を扱う操作に慣れるまで苦労することがあります。固定組織に比べて生細胞サンプルの調製ステップは多いため、この技術を視覚的に実演することが重要です。まず、凍結保存された不死化 N 19 oligo droog グリア細胞を 37 °C の恒温水槽で融解させます。細胞が融解するまで待ちます。

10% FBSおよび1%ペニシリン・ストレプトマイシンを添加した高グルコースDMEMを7 mL、10 cmカルチャーディッシュに加えます。次に、細胞懸濁液をプレートに滴下し、ペトリ皿を静かに揺らして細胞を均一に分散させます。その後、5%二酸化炭素インキュベーターにて34 °Cで4時間培養します。

プレートから培地を吸引し、残存するDMSO（凍結保存剤）を除去します。4〜7日間の培養後、7 mLの新鮮な培地と交換します。細胞が70〜80%のコンフルエンスに達したら、培地を吸引し、1 mLのドリップを細胞シート上にピペットで滴下し、室温で5分間インキュベートします。

次に細胞を回収し、回収した細胞を0.1 × 10⁶ cells/mLの密度で10 cm組織培養ディッシュに播種し、このディッシュを組織培養インキュベーターに入れます。さらに1回継代した後、細胞をライブセルイメージング実験用に播種できます。そのためには、前述と同様に細胞を回収し、細胞懸濁液を30 µL分取してヘモサイトメーターで細胞数をカウントします。

次に、滅菌済みのピンセットを使用して、未コーティングのガラスカバースリップを配置します。6ウェルプレートの各ウェルに、0.1×10⁶ cells/mLの密度で細胞を播種します。10% FBSおよび1% ペニシリン・ストレプトマイシンを添加したフェノールフリーのDMEM high glucose培地 2 mL中で、トランスフェクション前に34 °C、5% CO₂条件下で一晩細胞を培養します。

翌日、100 µLの無血清培地、0.5～4 µgの精製プラスミドDNA、および4 µLのFUgene HDを混合します。混合液を軽く2回ボルテックスし、室温で5分間静置してDNA複合体を形成させます。インキュベーション時間が経過した後、FUgene HD-DNA混合液を培養細胞に直接添加します。

プレートをゆっくりと傾けて混ぜ合わせます。その後、処理または実験を行う前に、34 °C、5% carbon dioxideの条件下でさらに48時間、細胞を培養します。まず、LCI Cham light live cell instrumentのコントロールボックスの電源を入れます。

ステージを十分に加温させるため、この操作は実験開始の3時間前に行う必要があります。最低限、コントロールボックスは実験開始の1時間前に電源を入れてください。次に、フローフード内で、LCI Cham light磁気型培養チャンバーとピンセットに70%ethanolをスプレーし、5分間乾燥させます。

インキュベーターから細胞を取り出し、顕微鏡下で観察して細胞が健全であることを確認します。細胞はガラスカバースリップ上で、多数の膜突起を持ち、健康的で十分に伸展している必要があります。突起の数が減少していたり、核の形状が不規則であったりする細胞は、トランスフェクションによるストレスを受けている可能性が高いため、クリーンベンチ内での以降の実験には不適切です。

6ウェルプレートを傾け、ピンセットでカバーガラスを取り出します。カバーガラスの細胞側を上にして、速やかにチャンバーのボトムプレートに配置します。カバーガラスを乾燥させないように注意してください。

次に、培養チャンバーの磁気本体を取り付け、元の6ウェルプレートから500 µLの培地をカバースリップの上に加えます。培地を再利用することで、環境変化によって細胞にかかるストレスを軽減でき、また細胞外分泌因子の評価にも有用です。培地を加えた後、培養チャンバーにガラスカバーを被せ、70%エタノールを浸したキムワイプを使用して、顕微鏡観察の妨げとなるカバースリップ底面の残留物を除去します。

培養チャンバーを34 °C、5% carbon dioxideのインキュベーターに30分間置きます。この手順により、チャンバー自体が34 °Cまで温まり、カバーガラスのずれを軽減させることができます。金属が温まる間、以降のステップでは室内の照明を可能な限り低くして作業する必要があります。

まず、Thoraによって事前に室温で調製されたnuke viewのelequaを用意します。次に、インキュベーターから培養チャンバーを取り出し、速やかに顕微鏡の環境チャンバー内に設置します。デュアルレギュレーターを備えた5%混合二酸化炭素タンクのバルブを開きます。

次に、顕微鏡ランプを約2.5 Vに設定し、露光時間を240 msとして、10倍対物レンズを使用します。明視野顕微鏡を用いてピントを合わせ、コンピュータモニター上で細胞を可視化します。その後、ペリスタルティックポンプを用いた低速かつ局所的な灌流による培地交換を行い、80 mM濃度のカリウムイオンまたはその他のアポトーシス誘導剤を細胞に添加します。

nuke view 4 88基質は細胞培養において安定しており、最大36時間の実験に使用可能です。したがって、この期間にわたる実験を行うことができます。まず、赤色および緑色蛍光タンパク質からの蛍光を可視化するように顕微鏡を設定してください。

次に、レッドチャンネルをクリックして、形質導入された細胞を表示させます。形質導入細胞が複数確認できるフレームを約12枚選択して保存し、これらのXYステージ座標を保存します。顕微鏡を用いて、保存したステージ座標において、明視野、レッドチャンネル、およびグリーンチャンネルの画像を6分ごとにキャプチャするように設定します。

重複または三重の実験から複数のXYポイントを収集した後、異なる日に実施された個別の実験データをまとめ、記述プロトコルに従ってデータ分析および統計検定を行い、CASPベイ陰性細胞とCASPベイ陽性細胞の比率を比較します。Nuke view 4 88基質は、N 19オリゴDDRグリア細胞培養におけるアポトーシス率の上昇を示すことがあります。高細胞外カリウム濃度での処理後、これらのベースライン画像は10倍対物レンズを用いて取得されました。

N 19細胞にRFPをトランスフェクションし、コントロール細胞にはNukeView 488基質を3 µL添加し、処置群の細胞にはNukeView 488基質3 µLと80 mMカリウムを添加した。これらの画像は、80 mMカリウムでの処置後3時間、6時間、9時間と経過するにつれてアポトーシス細胞数が増加することを示している。コントロール条件下では、80 mMカリウム処置群と比較して有意な量のアポトーシスは見られなかった。コントロール条件下で観察される背景の緑色信号は、細胞外カリウムの添加なしにアポトーシスを起こしている細胞を示している。

神経学的損傷に関する研究には、12時間のタイムコースで十分です。12時間後、カリウム処理した培養細胞では約45%の細胞死が認められました。対照実験の細胞では、12時間の時点でアポトーシスを示す細胞はほとんどありませんでした。ただし、状況によっては、より長時間の実験が必要となる場合があります。

このグラフは、12時間の実験期間におけるcaspase three陽性細胞の増加を示しています。習熟すれば、この手法は1時間で完了でき、適切に行えば一晩でデータを収集することが可能です。この手順を試みる際は、手順に沿って各処理間で一貫性を保つことが重要です。

免疫染色などの他の手法を用いて、研究対象となるパスウェイに関与する他の下流タンパク質を観察することができます。このビデオを視聴することで、イメージング用サンプルの調製方法について十分に理解できたはずです。データセットを取得し、データを解析してください。