マイクロ流体液滴のプラットフォームのための蛍光検出法

こんにちは、ジャージーです。こんにちは、シャビです。私たちはロンドン・インペリアル・カレッジのポストドクトラル研究員で、アンドリュー・ディ・メロ教授とジョシュ・デル博士のもとでマイクロ流体ドロップレットプラットフォームの研究に取り組んでいます。ドロップレットベースのマイクロ流体プラットフォームは、非常に高精度に定義された容量で液滴を生成でき、その生成頻度は毎秒数キロヘルツに達することもあるため、より高スループットな実験を実現するための有望な候補となっています。

さらに、関心領域をわずか数リットルほどのコンパートメントに封入できるため、クロストークと分散の両方を排除でき、分析プロセスのタイミングをより正確に制御することが可能です。当研究グループでは、ポリメラーゼ連鎖反応、ナノ粒子合成、単一分子細胞アッセイなど、多くのアプリケーションにマイクロドロップレットプラットフォームを導入し、すでに成果を上げています。

これらのシステム内で生成される大量の情報は、効率的に抽出、活用、および利用される必要があります。この点において、最適な検出方法は、適切であること、高感度で低い検出限界を提供すること、幅広い分子種に適用可能であること、非破壊的であること、そしてマイクロ流体デバイスに容易に統合できることが求められます。このニーズに応えるため、我々は、小容量の環境から大量の物理情報を抽出することを可能にし、広範囲の物理的、化学的、および生物学的因子の分析に適用可能な、一連の実験ツールとプロトコルを開発しました。

本プロトコルでは、液滴（Dropbox）内での単一細胞の検出および混合プロセスのマッピングに適用される2つの手法を提示します。マイクロ流体チップは、通常、フォトリソグラフィ法を用いてポリジメチルシロキサン（PDMS）で製作されます。このプロセスは、クリーンルーム施設で実施する必要があります。まず、シリコンウェハー上にSU-8 50をスピンコートし、ホットプレートを用いて65 °Cおよび95 °Cでソフトベークして、溶媒を蒸発させ膜を緻密化させます。冷却後、適切なマスクを用いてSU-8レジストにUV照射を行い、その後、冷却してウェハーを65 °Cおよび95 °Cでベークします。

適切な現像液を用い、攪拌しながら未露光領域を現像します。新鮮なEC溶媒でウェハを洗浄し、その後ガスで乾燥させて清潔な表面を作成します。ヘキサンおよびメタノールを用いてウェハを洗浄します。

また、エステートマスターの作製工程を完了させるために、デシケーター内で表面に固定剤を40分間蒸着させます。構造化されたマイクロ流体基板を形成するには、樹脂架橋剤とS guard 1 8 4を10:1の比率で混合し、これをマスターの上に流し込みます。これをデシケーター内で脱泡し、デバイスを65 °Cで硬化させます。

硬化したPDMSを切り出し、マスターから剥がします。バイオプシーパンチを用いて、流体チューブ用のアクセスホールを作成します。さらにPDMSの層を重ね、65度で20分間硬化させます。

準備した上層を下層の上に重ね、65℃で一晩キュアします。ペトリ皿からチップを剥がし、細かく切断します。チップの作製が完了したら、目的の溶液を注入して使用できます。

必要な溶液をシリンジに充填し、チューブのどの部分にも気泡が残っていないことを確認します。液滴生成には2つの相を使用します。水溶性分散相には、目的の試薬が含まれています。

油相を連続相として機能させます。シリンジ針先の先端と同じ内径のチューブを針に装着し、シリンジをシリンジポンプにセットして、目的の注入流速を設定します。各相について、水相によるPDMSの濡れを防ぎ、液滴形成の不安定化を回避するため、油相と水相の流速比は最低でも1以上であることが推奨されます。チューブの反対側の端を、PDMS基板に開けられた穴に直接接続します。

より複雑な溶液を用いる場合は、シリカ、キャピラリーポート、またはコネクタを導入することも可能です。チップの出口ポートをチューブに接続し、廃棄物回収用またはさらなる分析処理用のコレクターに導きます。このセットアップが完了すると、液滴を生成するためのマイクロチャネルの主な構成として、フローフォーカシング形式またはT字ジャンクション形式の2種類が利用可能です。これは、これらの形状を用いて2つの許容流体を合流させることで生じるせん断力と、それに続いて界面に形成される毛管不安定性によるものです。

数フェムトリットルほどの微小な単分散液滴が自発的に生成されます。液滴が生成されると、光学系を用いてそれらをプローブすることができます。光学系のセットアップは以下のプロトコルに従って行います。

自動サブミクロンポジショニング機能を備えた共焦点顕微鏡と、使用する蛍光色素の吸収波長に適合した波長のレーザーを使用します。蛍光寿命イメージングでこれらを励起させるには、数MHzの繰り返し周波数で動作するパルスレーザーを使用します。痰の実験では、ビームステアリングミラーと光学系を用いて、ビームの方向だけでなくビームの高さも制御します。

ダイクロイックミラーを使用して、レーザービームを対物レンズに反射させます。2本のレーザーを同時に使用する場合は、デュアルバンドダイクロイックミラーを設置できます。2本のレーザービームを反射させ、マイクロ流路内でレーザー光を鋭く集光させるために、無限遠補正の高開口数NA顕微鏡対物レンズを使用してください。

同一の高NA対物レンズを用いて、マイクロ流路チャネル内の試料から放出される蛍光を収集し、同一のダイクロイックミラーを透過させます。シングルバンドまたはデュアルバンドの放出フィルターを用いて、残留している励起光を除去します。蛍光放出を75 µmのピンホールに集光させます。

平凸レンズを使用します。ピンホールを顕微鏡対物レンズの共焦点平面に配置してください。別のダイクロイックミラーを使用して、蛍光信号を2つの検出器に分割します。

ダイクロイックミラーで反射された蛍光をエミッションフィルターでフィルタリングし、平凸レンズを用いて第1検出器に集光させます。2つ目の赤色蛍光色素を用いる実験では、ダイクロイックミラーを透過した蛍光を別のエミッションフィルターでフィルタリングし、さらに別の平凸レンズを用いて第2検出器に集光させます。蛍光光子の検出にはアバランシェフォトダイオードを使用してください。

蛍光データの収集には、アバランシェフォトダイオード検出器からの電子信号を、パーソナルコンピュータで動作するデータロギング用の多機能DAQデバイスに接続します。痰を用いた実験では、パルスレーザーを使用し、検出器を別のPCに搭載された時間相関単一光子計数（TCS）PCカードに接続します。このカードを用いることで、蛍光寿命データの取得が可能になります。

TCS PC法を用います。検出された個々の蛍光フォトンの入射レーザーパルスとの相関をとることで、放出された各蛍光フォトンの遅延時間が割り当てられます。このデータを単一または多重指数関数的な減衰曲線にフィッティングさせることで、蛍光分子の放射速度の推定値を得ることができます。

細胞は生物学的、物理的、および化学的な視点から非常に不均一であることが分かっています。したがって、理想的には、個々の細胞を一つずつ解析すべきです。しかし、信頼性と意義のある結論を導き出すために十分な定量的情報を収集するには、アッセイを高スループットで実施する必要があります。

ここでは、単一の水滴内にE. coli細胞を封入する例を示し、その実施方法を説明します。一晩培養したE. coli Top 10株を使用してください。細胞の生存率を検出するために、Cyto 9およびプロピジウムヨードを使用します。

どちらの染料もDNAインターカレーション染料であり、その蛍光強度は20倍以上に増加します。DNAに結合すると、SYTO 9は膜透過性を持つ緑色蛍光染料として機能し、プロピジウムヨードは膜不透過性の赤色蛍光染料として機能します。

したがって、生存細胞は緑色の蛍光を発し、死細胞は緑色と赤色の両方の発光を示します。ここでは、Tジャンクションによる液滴の生成と単一細胞の封入を確認できます。このビデオは高速カメラで撮影されましたが、液滴は1秒間に数千個の速度で生成することが可能です。

細胞を封入する際は、生成される液滴よりも細胞数が少なくなるように細胞培養液を希釈し、シリンジやチューブ内で起こりうる細胞の沈降を防ぐ必要があります。シリンジ内にマグネチックスターラーバーを使用し、細胞が溶液中に均一に分散した状態を維持してください。シリンジとマイクロチップの接続には、50 µmという非常に細いチューブを使用してください。

これにより、チューブ内の流速が速くなり、細胞の沈降を防ぐことができます。以下は、細胞を用いた実験における時間関数としての光子計数の代表的な例です。液滴内の混合プロセスのマッピングに使用します。

寿命の異なる2種類のフルオロフォアを用いて液滴を生成することができます。流動する液滴内では流れ場が形成され、最終的に、元々分離していた2つの溶液が混合されることで混合プロセスが促進されます。曲がりくねったチャネルを使用することで、流れ場の対称性を変化させることが可能です。

液滴をプローブするため、液滴が流れているマイクロチャネルの高さ半分に光学プローブ体積を合わせ、チャネルの一端から開始して、チャネル幅全体にわたり1 µm間隔で各実験を行います。液滴に由来する単一のバーストをオイル相のノイズ背景から区別し、各バーストの持続時間を決定するためのアルゴリズムを実装してください。

次に、実験が行われた特定の幅において、各液滴の長さに沿った遅延時間と強度の値を抽出するための2つ目のアルゴリズムを実装します。その後、最大尤度推定（MLE）アルゴリズムを用いて、実験における各液滴の蛍光寿命を評価します。実験に使用したすべての液滴の寿命値を平均化することで、MLE計算による最終的な誤差を低減させることができます。

より多くの液滴をプローブするほど、寿命の軌跡が得られた後の誤差は小さくなります。各幅について、すべての軌跡を2Dマップに統合します。各寿命値は2つの蛍光色素の特定の混合比に関連しているため、これにより濃度マップまたは混合マップを得ることができます。

本稿では、マイクロデバイスの作製方法、実験装置、およびそれに付随するマイクロドロップレットの生成、領域のカプセル化、およびそのプロセスであるドロップレットの光学検出に関するプロトコルについて説明しました。具体例として、ドロップレット内における単一細胞の検出と、ドロップレット内部での混合プロセスのマッピングの2点を選択しました。これらは、現在ドロップレットマイクロフルイディクスを用いて研究されている一般的なアプリケーションを代表するものです。

提示した実験が示すように、液滴マイクロ流体プラットフォームの使用には、完全な封じ込めによるハイスループットや再現性の向上といった魅力的な特性があります。また、生成される情報量が膨大であり、その生成速度も極めて速いため、これらの小型化プラットフォームの利点を最大限に活用するには、極めて高い時空間分解能を持つ高速検出法の利用が必要となります。

本事例では、高精度なフルオラス分光技術を用いることで、これが可能であることを実証します。