磁気ピンセットを用いた多重化単分子フォースタンパク質分解測定

この手順の全体的な目的は、単一タンパク質のタンパク質分解切断に対する機械的負荷の影響を、高度に並列的かつ費用対効果の高い方法で研究することです。このデモンストレーションでは、まずマトリックスメタロプロテアーゼ1によるコラーゲンの切断を検証します。フローセルのガラスカバーのスリップにコラーゲントリマーを固定し、続いて個々のコラーゲン分子にマイクロメートルサイズの磁性ビーズを付着させます。第2段階では、フローセルを磁気ピンセット装置に装着し、非特異的に付着したビーズがカバーのスリップ表面から除去されているかを確認します。

次に、プロテアーゼをフローセルに添加します。最終ステップは、ビーズの脱離をリアルタイムでモニタリングし、タンパク質分解速度を決定することです。さまざまなプロテアーゼ濃度および荷重条件下でビーズの脱離速度を測定することにより、極少量の基質とプロテアーゼを用いて標準的な酵素反応速度論的パラメータを導き出すことが可能です。

さらに、この手法は、タンパク質分解の速度および切断に伴う基質タンパク質の構造変化に及ぼす機械的な力の及ぼす影響について、独自の情報を提供します。光学的なTトレースや原子間力顕微鏡などの他の手法と比較した際の本手法の主な利点は、ハイスループットであり、コスト効率に優れていることです。この方法は単一タンパク質のタンパク質分解切断における有効な力に関する知見を提供できますが、その装置と技術は、タンパク質の折り畳みや高次構造に力が及ぼす影響を含む、広範な生物物理学的問題に適用可能です。

超音波洗浄を用いてカバーガラスを洗浄し、フローセルの準備を開始します。カバーガラスを、超音波洗浄機に収まるサイズの小さなガラス容器に入れます。容器にイソプロパノールを満たし、バス型超音波洗浄機で20分間ソニケーションします。その後、イソプロパノールを取り除き、カバーガラスを大量の脱イオン水で洗浄します。

容器に水を満たし、20分間超音波洗浄します。超音波洗浄後、ろ過されたダストフリーのエアストリームでカバーガラスを乾燥させます。カバーガラスを点検し、汚れのないもののみを使用してください。

カバーガラスをブンゼンバーナーのガス炎にかざし、数秒間軽く火あぶりにして、残っているほこりや水分を取り除きます。この際、過剰な熱でカバーガラスが歪まないように注意してください。この工程により、表面に残った汚染物質が除去されます。

次に、両面スコッチテープを使用して、2枚のカバーガラスを貼り合わせます。まず、長さ約3 cm、幅0.3 cmに切ったテープを、22 × 40 mmのカバーガラスに貼り付け、中央に1.6 cmのチャンネル（隙間）を残します。ピペットチップを使用してカバーガラスを軽く押し、テープが適切に密着していることを確認してください。

磁気ピンセット装置は、直径1 mmのピンホールを持つアルミニウム製L型ブラケットを用い、ピンセットの高さを調節するための垂直Z軸トランスレーターに取り付けることで、当研究室で構築しました。磁場勾配を形成するため、ピンホールの両側に2つの永久レアアース磁石をブラケットに取り付けました。本手順においては、磁気トラップの適切なキャリブレーションが不可欠です。

確実な結果を得るために、本セクションで概説する2つの異なる方法を用います。磁気トラップを校正するには、記述プロトコルに従い、5'末端と3'末端にビオチンとデキソジェンでラベルした、あらかじめ調製したラムダファージ由来DNAを使用してください。DNAをフローセルに固定するには、まずフローセルを抗デキソジェン抗体溶液で満たし、抗体がガラス表面に吸着するまで15分間静置します。

次に、BSA溶液をフローセルに注入して表面をコーティングし、DNAの非特異的な吸着を防止します。このブロッキングステップおよびそれ以降のすべてのステップにおいて、フローセルに注入する試薬量は、フローセル容量の少なくとも2倍にする必要があることに注意してください。本デモンストレーションでのフローセル容量は75 µLであるため、フローセルを室温で45分間インキュベートします。

この手順を繰り返した後、50 pMの機能化されたlambda DNAを加え、カバーガラスに付着させるために15分間静置し、過剰なDNAを1回分のXPBSで洗い流します。最後に、ストレプトアビジンコート超常磁性ビーズを加え、固定化されたDNAに付着させるために15分間静置します。このデモンストレーションでは、2.8 µmのビーズを使用しています。

過剰なビーズを1回分のXPBSで洗い流します。次に、永久磁石を試料表面から十分に離れた位置に移動させ、磁気ピンセットのキャリブレーションを行います。その後、準備したフローセルを顕微鏡に設置します。

永久磁石をフローセルの上方の所定の位置に移動します。両方のガラス表面から離れた位置にあるビーズに焦点を合わせ、Lambda DNA機能化ビーズの焦点面を選択してください。適切な焦点面とは、目的のビーズの中心が明るく見える面のことです。

80 Hz以上のサンプリングレートで、ビーズの運動を500フレーム分撮影します。磁石を試料表面に近づけ、各位置でのビーズの運動をビデオで記録します。5 mmを超える距離については1 mm刻みで、1 mmから5 mmまでの距離についてはさらに細かく移動させてください。

1 mm未満の距離では0.5 mm刻みで、それ以上の場合は0.25 mm刻みで移動させます。各データセットについて、2Dガウスフィッティングを用いてビーズの中心を追跡します。記述された手順に従い、ブラウンゆらぎを介して力を算出します。パワースペクトル線形フィッティングによる力計算を確認し、力の精度を検証します。

遮断周波数（ロールオフ周波数）を求めるために、印加力と遮断周波数の関係を、フローセルへのコラーゲンペプチドの固定に先立って、コラーゲンペプチドおよびMMP-1タンパク質を発現・精製して確認します。まず、抗MIC抗体溶液をフローセルに添加し、室温で20分間インキュベートして、抗MICをフローセルの表面に結合させます。5 mg/mLのBSAを用いてフローセルをブロッキングし、タンパク質の非特異的な吸着を防ぎます。次に、150 pMのコラーゲンペプチドを添加し、M-tagを介して抗体に45分間結合させます。

フローセルに2.8 µmのビーズを添加する前に、PBSバッファーを用いて過剰なコラーゲンを洗い流します。ビーズは強力な磁石を用いてstrep dividおよびコーティングビーズ溶液から分離させ、その後PBSで再懸濁させてください。この工程を3回繰り返します。

このステップは、2.8 µmのビーズを表面固定化されたコラーゲンペプチドに結合させるために不可欠です。次に、ストレプトアビジンコート超常磁性ビーズを添加し、コラーゲン分子に付着するまで45分間静置します。フローセルにコラーゲンペプチドと磁性ビーズが組み込まれたら、磁気トラップ内でフローセルのイメージングを行います。

低荷重下では、ビーズの一部が非特異的に表面に付着しており、結合が弱い場合があります。適度な荷重を加えることで、これらのビーズを確実に遊離させます。活性化させた酵素をフローセルに注入します。

本ケースでは、3.5 mM の PMA を添加して MMP1 をあらかじめ活性化させ、37 °C で 3 時間インキュベートしました。フローセルをマグネティックツイーザー装置に再導入した直後に、数個の視野にわたるビデオを記録します。これにより、通常、数百個の付着ビーズが得られます。この測定時点を時間 t = 0 とします。

すべてのビーズが脱離するか、あるいはそれ以上のタンパク質分解が認められなくなるまで、一定の時間間隔で複数の視野を記録する同じプロセスを繰り返します。磁気ツイーザーは、1 µmおよび2.8 µmのビーズを用いて校正されました。強制的なタンパク質分解実験において、観察されたブラウン変動の振幅と、さまざまな磁石位置におけるロールオフ周波数の算出の両方を用いることで、残存しているビーズの正規化数を時間の関数としてプロットし、タンパク質分解速度を算出することができます。

このプロセスは、異なる酵素濃度および荷重で繰り返すことができます。タンパク質分解速度は印加される荷重に依存します。本実験では、1 pN、6.2 pN、および 13 pN の荷重においてタンパク質分解速度を測定しました。

15分以降で未分解のままのビーズの割合は、異なる実験間でおよそ0.25とほぼ一定に保たれています。本研究において、このアッセイにより、印加された力の関数としてMMP1の触媒効率を測定することができました。データを分析した結果、コラーゲンの三重らせん構造は、タンパク質分解が行われる前に局所的に解く必要があることが分かりました。

この手法を習得すれば、正しく実施することで5〜6時間で完了させることができます。データの統計的有意性を十分に確保するためには、1視野あたり少なくとも30〜50個のビーズが必要であることに留意してください。また、PMAは極めて危険な可能性があるため、本実験の実施中は常に手袋、白衣、フェイスマスクなどの予防策を講じてください。

このビデオを視聴することで、磁気ピンセットを用いて単一タンパク質のタンパク質分解切断に対する力の効果を測定する方法について、十分に理解することができます。磁気ピンセットは、単一分子生物物理学的実験を理解するための優れたツールです。この手法は、他のプロテアーゼと基質の組み合わせにも応用することが可能です。

さらに、同様の手法を用いることで、タンパク質の構造ダイナミクスの解明だけでなく、RNAやDNAに結合または修飾を行う他のタンパク質の理解を深めることができます。