皮質ネットワークの開発で機能的カルシウムイメージング

この動画の目的は、カルシウム感受性蛍光指示薬を用いて、発達中の皮質脳スライスからネットワーク活動を測定する方法を実演することです。DY脳スライスは、若齢マウスの発達中の内側皮質から作製されます。ニューロンとアストロサイトの両方にカルシウム依存性マーカーを導入します。

カルシウム依存性色素の蛍光変化は、細胞活動の変化を反映します。アストロサイト、ミクログリア、内皮細胞などの非神経細胞は、特異的なマーカー色素を用いて染色可能です。皮質ネットワークの活動はタイムラプス多光子イメージングを用いて記録され、関心領域の3Dスタック画像を作成することで、ネットワーク内の細胞を検出します。

複数の細胞における細胞蛍光の変化を解析することで、発達中の皮質ネットワークの活動を読み取ることができます。発達中の神経系における活動の大きな特徴は、自発的な同期ネットワーク活動です。同期活動は、無傷の脊髄や皮質、および解離神経細胞培養においても、自発的活動期に多くの異なる発達中の神経領域で観察されています。神経細胞が脱分極して発火し、単一のスパイクまたは活動電位のバーストが発生すると、電圧依存性カルシウムチャネルを含む多くのイオンチャネルが活性化され、カルシウムの流入がもたらされます。

電場電極やマルチ電極アレイを用いることで、局所ネットワークから高度に同期した活動が測定されてきました。これらの手法は高い時間的サンプリングレートを可能にしますが、細胞活動が統合されて読み出されるため、空間分解能は低くなります。単一ニューロンのパッチクランプ電生理学を用いて発火率を測定することで、神経活動の単一細胞レベルでの分解能を得ることが可能です。

しかしながら、ネットワークからの測定能力は同時にパッチクランプされるニューロンの数に制限されており、通常は1つまたは2つのニューロンに限られます。カルシウム依存性蛍光指示薬を用いることで、細胞ネットワーク全体の同期した活動の測定が可能になりました。この手法は高い空間分解能と十分な時間サンプリングの両方を備えており、発達中のネットワークにおける自発的な活動を記録することができます。

URA 2:00 AM エステルなどの蛍光カルシウム感受性インジケーターは、カルシウムイオンに結合可能なカルボン酸基を有しています。これらの蛍光色素は、1光子または2光子顕微鏡を用いて、特定の光波長により活性化されます。カルシウムが結合すると、色素から放出される光子の数が一時的に変化します。

この光子数または蛍光の変化はdelta FFシグナルとして報告され、ニューロン内のカルシウム濃度の変化に対応します。カルシウム感受性インジケーターの変化を測定することは、発達中の細胞におけるネットワーク活性パターンの有用な読み出し指標となります。こんにちは、リアナ・モーティです。そして、私はジュリー・アボッツです。

私たちはアムステルダム大学の解釈神経生理学部門に所属しています。私たちは、多焦点イメージングにおけるカルシウム感受性指示薬を用いて、マウス皮質の発生組織における機能的活性を研究するためにカルシウムイメージングを利用してきました。この短い動画の目的は、これらの手法を用いて、神経系の発生ネットワークにおける自発的および誘発的な活性パターンをどのように測定できるかを実演することです。

神経回路へのダメージを軽減するため、若齢マウスの頭蓋骨から速やかに脳を取り出します。氷冷したスライス溶液中で脳を解剖します。このスライス溶液には、神経記録用のATSFで一般的に使用されるナトリウムの代わりにコリンクロリドが含まれています。

これらの実験では、発達中のマウス脳の腸管皮質から脳切片を作成します。ペトリ皿の上にフィルターペーパーを置き、数ミリリットルの A TSF で湿らせます。脳をフィルターペーパーの上に移動させます。

シングルエッジカミソリ刃を用いて、脳半球を二等分します。2つの半球を分離させます。一方の半球を、もう一方の半球と共に氷冷したスライス溶液に戻します。

カミソリで小脳を除去します。片側の半球を正中線上に折り返し、背側表面から約1 mmの深さで、刃先をわずかに吻側に向けるように切開します。脳を反転させます。

綿棒と金属製スパチュラを用いて、切断したばかりの面を清掃します。脳を金属製の切断ブロックに移動させます。綿棒で脳をスパチュラからそっと押し出し、接着面に載せます。

脳の300 Micrometerスライスを切り出します。若齢組織の切断速度およびブレード周波数は、通常、成熟組織に使用するものよりも遅く設定します。切り出した後、各スライスをガラスピペットを用いて、室温で酸素供給済みのA TSFを含む保持チャンバーに転送します。このA CSFには、通常のA CSF溶液よりも高いマグネシウム対カルシウム比が含まれています。

記録に使用するスライスは、1時間置いて回復させます。カルシウム依存性指示薬または細胞特異的マーカーを細胞に導入するには、染色手順のためにスライスをチャンバーに移す必要があります。市販のチャンバーも利用可能ですが、標準的な実験器具を用いて低コストで簡単に組み立てることができます。

染色チャンバーを作成するには、以下の基本的なラボ機器が必要です。プラスチック製のペトリ皿2枚、10 milliliter シリンジ1本、シリカチューブの一部、半透膜付きのセルカルチャーインサート、超強力接着剤、小型チューブコネクタ3個、および細い針です。大きなペトリ皿を用意し、加熱したロッドを用いて側壁に小さな穴を開けます。次に、小さなペトリ皿を用意し、シリコンチューブが通過できる十分な大きさで、同様の直径の穴を開けます。

シリコンチューブの一節を穴に通し、小さなディッシュ内でループを形成します。瞬間接着剤を用いてチューブの開口端を封止します。その後、チューブの残りの部分を小さなペトリ皿の内壁に貼り付けます。

小さいペトリ皿を大きいペトリ皿の中心に配置し、接着剤で固定します。シリコンチューブの残りの端を取り、ペトリ皿の側壁にある小さな穴に通します。細い針を用いて、ペトリ皿内部にあるシリコンチューブに小さな穴を開けます。

ガスパー融合を均一に行うため、等間隔に穴を開けます。加熱メスを用いて、半透膜付きの細胞培養ウェルに穴を開けます。ウェルの上端から1 cmを切り取り、インキュベーション中にスライスを保持するための浅いディッシュにします。

多孔性シリコンチューブで囲まれた小型ディッシュの中央に、浅いディッシュを配置します。大型ディッシュの蓋に、直径約0.5〜1 cmの穴を開けます。加熱メスを用いて、10 mLのプラスチック製シリンジを用意します。

シリンジの先端を斜めにカットして取り除きます。カットしたシリンジチューブの表面にシアノアクリレート系接着剤を塗布します。これを大きなペトリ皿の蓋にある穴の上に直接貼り付けます。

シリンジチップの先端にチューブコネクターを取り付けます。多孔性ガスチューブがディッシュの周囲に配置されるようにして、小型ペトリ皿の中央に浅いディッシュを置きます。次に、このチューブをカルボゲンガス供給源に接続し、スライスに酸素を供給します。

インキュベーション中、大きなディッシュの蓋を閉じます。この蓋はシリンジチップを介してガス供給源に直接接続されています。これにより、インキュベーション中にスライス上にガスが供給され、染料の退色が防止されます。すべての操作は可能な限り遮光して行い、染料とスライスの両方を暗所に保持します。

スライスホルダーを用いて、染色チャンバーにA TSFを約1.5 mL注入します。インターフェースチャンバーを内部に配置し、さらに1 mLのA TSFを注入します。組織の健全性を維持し、スライスを適切にロードさせるために、十分な酸素供給を維持することが重要です。

染色チャンバーの加熱中に、ニューロンへの染料の取り込みを促進するため、約35 °Cで染色を行います。fira 2:00 AM Ester用の指示染料を調製します。50 µgのバイアルに、9 µLのDMSOと1 µLのonic acidを加えます。

DMSOおよびオニ酸。これらは透過化剤として機能し、色素が脂質膜を透過して取り込まれるのを可能にします。色素が完全に溶解するように、バイアルを15分間ボルテックスしてください。

染色のために、各スライスをインターフェースに転送します。染色チャンバーに挿入してください。スライス上の目的領域に染料を直接滴下し、染色チャンバーの蓋を閉じます。

使用したマウスの年齢に応じて、スライスを暗所で20分から40分間インキュベートします。インキュベーション後、スライスをスライスホルダーに戻し、残っている過剰な染料を洗い流します。カルシウムイメージング用の染色プロトコルは、より高齢の組織に合わせて調整することも可能です。

これには、追加の事前インキュベーション工程が必要です。古いスライスを、3 mLのCSFおよび0.5%のcrema four溶液 8 µLを満たした浅い事前インキュベーション皿に移します。35 °Cで3分間加熱します。その後、スライスをインターフェースに移し、染色チャンバーに挿入して、通常の染色手順に従います。

これらのスライスを用いて、非神経細胞、すなわちアストロサイト、ミクログリア、および内皮細胞を染色することも可能です。アストロサイトを染色してスルホロドタミンで標識するには、スルホロドミン1 0 1を使用できます。10 µMの溶液を調製し、スライスの関心領域に紫色の染料をピペットで滴下します。

15分間インキュベートします。スライスを保持チャンバーに戻し、余分な染料を除去します。トマトレクチンのFSE共役体は、ミクログリアおよび内皮細胞を染色することができます。

トマトレクチンの20 µg/mL溶液を調製します。切片の目的領域に染料を滴下します。切片を45分間インキュベートします。

その後、スライスを再度保持チャンバーに戻します。イメージングの間、スライスは顕微鏡下で安定している必要があります。通常、組織を固定するためにメタルハープが配置されますが、これによりスライス表面が不均一に歪み、フォーカスが合うイメージング視野が制限されることがあるため、注意が必要です。

これらのスライスは、ポリエチレン（POLYETHALINE）またはPEI溶液を用いて記録チャンバーに固定します。PEIは、少なくとも1時間、細胞の表面への付着を促進するために使用されるポリマーです。スライスを記録チャンバーに配置する前に、チャンバーの底面を覆うように数mLのPEI溶液を満たしてください。

まず、蒸留水でチャンバー内のPEIを洗い流し、続いてCSF溶液で置換します。スライスを記録チャンバーに移動させ、余分なCSF溶液を除去します。細い筆を使用して、スライスをチャンバーの中央に配置します。

吸収性のフィルターペーパーの小さな破片を用いて、残っているA CSFをすべて取り除きます。スライスの周囲にA CSFが残っていないことを十分に確認してください。最後に、スライスをチャンバーから離さないように注意しながら、0.5 mLのA CSFをスライス上にそっと滴下します。

チャンバーを酸素供給された大きなインターフェースコンテナに入れ、暗所でさらに1時間放置します。カルシウム感受性指示薬の色変化は、1光子または2光子顕微鏡を用いて記録できます。本研究では、神経ネットワークの2光子イメージングを可能にするため、Olympus顕微鏡にチタンサファイアレーザーを組み合わせて使用しています。

さらに、フレーム走査速度を向上させるため、EM CCD hammer MATSUカメラを搭載したL Vision biotech trim scopeシステムを使用します。1.6 millimolarのカルシウムおよび1.5 millimolarのマグネシウムを含む酸素化A-T-S-F-A-T-S-Fを安定したフローで流しながら、スライスチャンバーを顕微鏡下に配置します。このセットアップでは、白色光を用いて約30 °Cに加熱します。

スライス内の関心領域を特定し、表面に焦点を合わせます。消灯し、記録用キャビネットのドアを閉じます。これは背景光のレベルを下げるためです。

画像の記録および解析には、多くの異なる市販またはオープンソースのソフトウェアパッケージが利用可能です。当研究室では、Lavis Biotech社製のInspectorソフトウェアを用いて画像取得を行っています。イメージングを開始するには、検出用にCCDカメラモードを選択してください。使用するインジケーターに適した波長を設定します。

fira 2:00 AM Esterの場合、trim scopeソフトウェアで励起波長を820 nanometersに設定します。64 Bスキャンモードを選択してください。解析対象領域に合わせて、最適な視野サイズとピクセル解像度を選択します。

画像サンプリングに合わせて、適切なフレームレートと、必要に応じてピクセルスピニングを選択します。連続イメージングに向けてレーザーシャッターを開きます。連続イメージングモードを使用します。

ゲインとレーザー強度を調整し、イメージングしたい神経ネットワークにフォーカスを合わせます。スキャンを停止します。フレームレートとシーケンス期間のタイムラプス設定を選択します。

タイムラプスイメージングの後、上方向20 µmおよび下方向20 µmまで、1 µmステップでZスタック画像を撮影します。このZスタックは、解析時の細胞検出に使用されます。記録されたファイルをTIFF画像のスタックとしてエクスポートします。

結論として、本動画ではカルシウムインジケーターを用いて、発達中の皮質における同期的な自発的ネットワーク活動を測定する方法を示しました。ご自身の研究室でこの手法を導入するための方法論および試薬に関する詳細は、本動画に付随するデータシートをご参照ください。