スルー代謝経路の確認と発見 ^{13 C標識}

このプロトコルの目的は、炭素13（13C）を用いた代謝解析により細菌の代謝を研究することです。まず、標識された炭素基質存在下で微生物を培養し、微生物のタンパク質に炭素を組み込ませます。その後、微生物を回収し、アミノ酸を抽出、加水分解、および誘導体化します。

サンプルをガスクロマトグラフ質量分析計（GCMS）に導入します。生化学的ネットワークにおける代謝物間の原子転移経路を追跡することで、微生物が利用している機能的な代謝経路を特定できます。私はバート・バーラです。

ここで提示する方法は、微生物における代謝経路を決定するためのトランスクリプトミクスやプロテオミクスの補完として利用できます。私たちはこの手法を用いて、シアノバクテリアなどの光合成微生物におけるマイオトロフィックまたはヘテロトロフィックな炭素利用について調査してきました。本ビデオでは、標識炭素基質を用いて新しい酵素機能を探索する方法を実証するため、モデル株としてANOTHE 5 1 1 42を使用します。

本手順のデモンストレーションを行うのは、私とli Yu、およびChu Yang Fangです。まず、ラベル化されていない培地でcyana thesei細菌を培養します。細菌が対数増殖期の中期に達したら、その3%（容量比）を炭素13ラベル化培地に接種します。

次に、初期接種源の継代培養からラベルされていない炭素が、対数増殖期中期の同一の標識培地へと導入されるのを防ぎます。$^{13}$C標識されたCy Thesei細菌が対数増殖期中期に達したとき、遠心分離により10 millilitersを回収します。ペレットを6 molarの塩酸1.5 millilitersに再懸濁し、透明なガラス製のネジ蓋付きガスクロマトグラフィー（GC）バイアルに移します。

バイアルに蓋をし、100 °Cのオーブンに24時間置いて、バイオマス蛋白をアミノ酸に加水分解させます。バイオマスペレットの加水分解により、20種類の一般的なアミノ酸のうち16種類が得られます。加水分解後、アミノ酸溶液を2 mLマイクロ遠心チューブに移し、20,000 ×gで5分間遠心分離します。加水分解後、アミノ酸溶液を2 mLマイクロ遠心チューブに移し、20,000 ×gで5分間遠心分離して、固形粒子を沈殿させます。

遠心分離後、加水分解溶液中の固形粒子がGCカラムに流入しないよう、上清を新しいGCバイアルに移します。次に、アミノ酸をガスクロマトグラフィーで分離可能な揮発性にするために誘導体化します。乾燥させたサンプルを150 µLのテトラヒドロフラン（THF）および150 µLのN-メチル-N-トリフルオロアセトアミドとN,O-ビス(トリフルオロアセチル)アミンに溶解させます。

アセトアミドおよび T-B-D-M-S 誘導体化試薬を加え、すべてのサンプルを65〜80°Cのオーブンで1時間インキュベートします。バイアル内の代謝物が完全に溶解するように、時々ボルテックスミキサーで撹拌してください。サンプルを20,000 ×gで10分間遠心分離し、上清を新しいGCバイアルに移します。

上清は透明な黄色い溶液であるはずです。GC温度は以下の通りとし、150 °Cで2分間保持します。その後、毎分3 °Cの速度で280 °Cまで昇温させます。

毎分20 °Cで300 °Cまで昇温し、その後5分間保持します。次に、30 mのGCカラムを使用する場合、溶媒遅延時間を約5分に設定し、質量電荷比（m/z）の範囲を60から500までに設定します。1 µLの注入量、1:5または1:10のスプリット比、および1.2 mL/minのヘリウムキャリアガスを用い、この分析条件に従ってGC-MSでサンプルを分析します。

Microsoft Excelを使用してGCMSデータを解析します。各アミノ酸のGC保持時間および固有の質量電荷比ピークをこの図に示します。T-B-D-M-S誘導体化アミノ酸は、通常、MSによって2つの電荷断片に明確に分割されます。一つはアミノ酸全体を含む断片M-57であり、もう一つはロイシンおよびイソロイシンにおいてアミノ酸のα-カルボキシル基を欠く断片M-159です。

M-57ピークは、他の質量ピークフラグメントと重複していました。N-15を用いることで、アミノ酸ラベル全体を分析することが可能です。また、F 3 0 2グループは多くのアミノ酸で検出され、これにはアミノ酸主鎖の最初のα-カルボキシル基と2番目の炭素のみが含まれています。

しかし、このMs.Peakは多くの場合、信号対雑音比（S/N比）が高いため、代謝フラックスを定量的に分析することにF 3 0 2は推奨されません。アミノ酸や中心代謝物の誘導体化により、carbon 13、oxygen 18、silicon 29、およびsilicon 30を含む、相当量の天然ラベル同位体が導入されます。生の質量同位体またはスペクトルにおける天然同位体由来の測定ノイズは、公開されているソフトウェアを使用して補正することが可能です。

最終的な同位体標識データは質量分率として報告されます。例えば、M0、M1、M2、M3、およびM4は、$^{13}\text{C}$標識炭素を0個から4個含むフラグメントを表します。この5 1 1 2には、典型的なイソロイシン合成経路においてトレオニンから2-ケト酪酸への変換を触媒する酵素であるトレオニン・アンモニアリアーゼは含まれていません。

したがって、本生物におけるアイソール経路を解明するため、Cyana THESEI 5 1 1 42 を 54 millimolar のグリセロールを含む ASP two 培地で培養し、本ビデオで説明するように GCMS で分析しました。ここで示すように、Cyana Thesei 5 1 1 4 2 は 2 位標識グリセロールを主な炭素源として利用しており、ピルビン酸を前駆体とするトレオニンとアラニンには 1 つの標識炭素が認められた一方、イソロイシンは 3 つの炭素が標識されていました。したがって、Cyana THESEI 5 1 1 4 2 における合成は、多くの生物が採用しているトレオニン経路に由来するものではないと考えられます。一方で、ロイシンとイソロイシンは、フラグメント M-15 およびフラグメント M-159 に基づいて同一の標識パターンを示しました。

例えば、断片化されていないアミノ酸を含む$^{15}\text{N}$の同位体またはデータでは、ロイシンとイソロイシンの標識が同一であることが示されました。したがって、ロイシンとイソロイシンは同じ前駆体であるピルビン酸とアセチル-CoAから合成される必要があります。この観察結果は、イソロイシン合成におけるシトラマレート経路の標識炭素転移と一致しています。

この手法は、多種多様な微生物の代謝を調査するために使用でき、習得すれば、開始から完了まで約1週間で実施可能です。