タイムラプスビデオ顕微鏡を用いた細胞のランダムな移行の定量分析

本実験の全体的な目的は、ビデオタイムラプス顕微鏡を用いて、細胞の遊走をリアルタイムで定量的に測定することです。まず、6ウェル培養プレートにコラーゲンをコーティングし、そこに目的の細胞を低密度で播種します。次に、ピペットチップを用いてプレート上に傷（ウィンドウ）を作成し、細胞が遊走するための十分なスペースを確保します。

次に、顕微鏡をセットアップし、温度制御システムを用いて一定の間隔で画像をキャプチャすることで、遊走する細胞をリアルタイムで継続的にモニタリングします。最終的に、パーティクルトラッキングプロトコルを用いて、試験群と対照群の細胞における平均速度と総変位の差を評価します。回避チャンバー遊走アッセイのような既存の手法に対する本手法の主な利点は、エンドポイントの定量的な遊走測定に基づかないことです。

その代わりに、さまざまなパラメータを継続的にモニタリングし、算出することが可能になります。この手法は、特定の遺伝子や薬剤が腫瘍細胞の遊走にどのように影響するかなど、がん生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。処置の2日前に、Opti-MEMで希釈したコラーゲン1.5 millilitersを6ウェル培養プレートの各ウェルに加え、処置の前日にプレートを4 °Cで一晩インキュベートします。

目的の細胞を、ウェルあたり2 mLのFBS添加DMEMに再懸濁し、コラーゲンENCコートプレートの各ウェルに播種して、37°Cで一晩インキュベートします。処置当日、ピペットチップを用いて一晩培養した細胞に傷（創傷）を作り、PBSで各ウェルを洗浄して、傷によって生じた細胞片を除去します。

洗浄済みのウェルにFBS添加DMEMを加え、顕微鏡下で清浄な創傷領域が形成されていることを確認します。顕微鏡カメラとライブセルイメージング装置の電源を入れ、プレートを顕微鏡ステージ上に配置します。プレートを新しいライブセル環境制御チャンバーで覆い、温度設定を37 °C、二酸化炭素濃度を5%に設定します。次に、メニューバーからスライドブックソフトウェアを開きます。

円の中にFと書かれたボタンをクリックして、フォーカス制御を選択します。対物レンズボックスのドロップダウンウィンドウを使用して、対物レンズを指定します。フィルターセットボックスで、光路をIピースに向ける設定を選択します。明視野照明に適したフィルターを選択し、「Bright」を開きます。

明視野シャッターを開きます。次に、ターレットで明視野フィルターを選択し、接眼レンズを通してサンプルを観察して、適切な視野を探し、サンプルに焦点を合わせます。その後、フィルターターレットを移動させて、光路をカメラに切り替えます。Slidebookソフトウェアで画像をキャプチャするには、[focus control]をクリックし、[XY]を選択して接眼レンズを通して異なる位置を選択し、[set point]をクリックして各位置を固定します。

画像キャプチャを行う際は、画面上のカメラ画像を参考に手動でフォーカスを微調整し、次にフォーカスコントロールウィンドウのツールを使用してステージのZ位置を調整します。最適な結果を得るには、フォーカス合わせを容易にするため、プレートとの接点付近にある平坦な細胞突起に焦点を合わせてください。スライダーを使用して、フォーカス合わせに適した範囲に露光時間を調整します。

複数のXY座標を選択した場合は、フォーカス制御を選択して各座標のフォーカスを調整します。次にXYを選択し、その後、ビジットポイントを選択します。Slidebookのメニューバーからカメラのアイコンを選択し、キャプチャタイプを選択してから、タイムラプスを選択して実験時間を設定します。

ドロップダウンメニューから、あるタイムポイントの開始から次のタイムポイントの開始までの希望する遅延時間を入力します。インターバルフィールドでは、手動で入力された値に基づいて3番目のフィールドが自動的に計算されます。「multiple XY capture」の下で、XY位置が複数ある実験の場合は「multi-point list」を選択してください。

最後に、保存するファイルに名前を付け、「capture control」に移動して「advanced」を選択し、「spool」を選択します。その後、各タイムポイントごとに「capture to memory」を行い、「save to spool file」で保存してください。まず、imageをクリックして開始します。

スライドブックのメニューバーで、ドロップダウンメニューから「import」を選択し、「slide book spool」をクリックします。さまざまな領域およびタイムポイントの移行実験から生成された、目的のスライドブックファイルを選択します。最初のファイルを開き、メニューバーで「mask」を選択して、ドロップダウンメニューから「particle tracking protocol」を選択します。

パーティクルトラッキングメニューから、「manual particle tracking protocol」を選択します。開始時間と終了時間を指定するウィンドウが表示されます。ランダム移動を解析するには、「mask」を選択し、次に「particle tracking protocol」を選択してください。さらに、オブジェクトの中心座標を決定するために、「center of area」を選択します。

次に、「track」をクリックして続行します。ここで、変位や平均速度など、各パスについて必要な統計項目を選択します。ここに示すように、「calculate」をクリックして統計結果を表示します。

速度として定量化したランダム移行解析の例をこのボックスに示します。ウィスカー図において、本実験では、腫瘍抑制遺伝子をノックダウンしたM-D-A-M-B 2 31細胞で平均速度の上昇が見られました。ここでの対照群であるM-D-A-M-B 2 31細胞と比較して、最初の図の細胞のランダム移行を細胞変位の観点から解析しました。

改めて、全腫瘍抑制遺伝子ノックダウン群では、対照群のM-D-A-M-B 2 31と比較して細胞変位が増加していました。このタイムラプスビデオ顕微鏡動画では、対照群のMDA MB 2 31細胞をコラーゲン上に一晩播種しました。その後、ランダムな遊走中の画像を1時間間隔で計18時間撮影しました。

時間の経過とともに、細胞が元の位置から離れて移動していく様子に注目してください。この動画では、コラーゲン上に一晩播種した後のテストM-D-A-M-B 2 31細胞の遊走を記録し、解析しています。前の動画のコントロール細胞と比較して、テスト細胞はより遊走性が高いことに留意してください。

この手順に続き、細胞浸潤やdynasなどの他の手法を行うことで、がん転移の発生後における細胞の役割は何かといった追加の疑問を解明することができます。この技術は、細胞生物学分野の研究者が、単離したがん細胞株を用いて細胞遊走を探索するための道を開きました。