ホールマウントマッスル分析による再現性のあるマウスの坐骨神経クラッシュと再生のその後の評価

本手順の全体的な目的は、坐骨神経挫傷およびその後の筋肉再支配のホールマウント解析における、簡便で再現性のある方法を実演することです。まず、外科的牽引器を適切に配置して神経への良好なアクセスを確保し、坐骨神経を露出させます。次に、止血鉗子で神経を挫傷させ、活性炭で神経に印を付けます。

次に、後肢から坐骨神経が支配している個々の筋肉を取り出します。最終ステップとして、免疫染色後、ホールマウント解析のために個々の筋肉を解剖します。最終的に、これらの結果は、再現性のある坐骨神経挫滅を簡便に実施でき、筋肉のホールマウントを用いてその後の再生を解析できることを示しています。

この手順の主な利点は、坐骨神経を圧砕し、その後の軸索再生をスコア化するための、簡便で再現性の高い手法を提供することです。まず、術後の痛みを最小限に抑えるため、ケタミン 100 mg/kg とキシラジン 10 mg/kg の混合液を腹腔内投与し、マウスを麻酔します。また、メラノキサム 10 mg/kg を皮下投与します。

次に、外科用クリッパーを用いて両後肢を慎重に剃毛します。その後、完全に除毛するために除毛クリームを塗布します。滅菌綿棒とベタジン外科用スクラブを用いて皮膚を洗浄します。

その後、滅菌綿棒を用いて眼科用軟膏を眼に塗布します。マウスを予熱した恒温ブランケット上の清潔なステンレス製プレートに置き、動物の体温を37 °Cに維持します。次に、すべての肢をテープで固定します。

後肢を、膝関節が身体に対して直角になるように慎重に対称的に配置します。続いて、顕微鏡下で手術部位を滅菌ドレープで覆います。正中線に沿って半円形の切開を行います。

皮膚を下の筋肉組織から慎重に剥離し、適宜折り返して保持します。処置中に手術部位を湿潤に保つため、滅菌生理食塩水を約0.1 milliliters投与します。次に、大殿筋と大腿二頭筋短頭の間の筋膜面を開きます。

外科的コントロールのために坐骨神経を露出させます。対側の坐骨神経を露出させ、可動化しますが、そのまま保持します。その後、臀筋を元に戻し、縫合します。

リトラクターを用いて、同様の方法で実験対象の坐骨神経を露出させます。視認性を高めるため、虹彩切除用ハサミを使用して、周囲の結合組織から坐骨神経を慎重に剥離します。

次に、5 45 微細鉗子を用いて、神経を超微細止血鉗子の下顎に配置し、3本の筋膜が重なり合わないように隣り合わせに並べます。止血鉗子の先端から 1.5 mm の位置にはマークが刻まれています。圧砕する前に、坐骨神経の最も外側の部分をこのマークに合わせて配置してください。

これにより、均一な幅で圧砕され、圧砕力によって扁平化した際に神経が止血鉗子の顎の外に飛び出さないことが保証されます。神経が鉗子の先端からはみ出している場合、神経の一部しか圧砕されません。あらかじめカーボン粉末に浸した別の止血鉗子を使用して、圧砕部位に印を付けてください。

同じ圧挫部位で、3クリックの強さで15秒間神経を圧挫させます。カーボンによる標記が、最初の圧挫範囲を超えて広がらないようにしてください。圧挫部位を正確に標記する必要がある場合は、鉗子をあらかじめカーボンに浸し、手術部位にカーボンが広範囲に付着することを防ぐことが特に重要です。

粉末状のカーボンの中で止血鉗子を開きます。その後、ゆっくりと閉じます。滅菌ガーゼを使用して、止血鉗子の外側にあるカーボンを拭き取ります。

3倍以上の倍率で鉗子を確認し、圧砕面がカーボン粉末で均一にコーティングされていることを検証します。必要に応じて、再度浸漬し、拭き取ります。その後、対側と同様の手順で臀部筋を再配置し、縫合します。最後に、9 mmのリフレックスクリップを用いて皮膚切開部を閉じます。

9 mmのリフレックスクリップで動きが制限される場合は、より小さなリフレックスクリップまたは6つのオートサチャーを使用できます。その代わり、マウスを犠牲にした後、後肢の前脛骨筋、長趾伸筋、長腓骨筋、およびヒラメ筋の4つの筋肉を、結合組織を介して黒色のサルディンコーティング皿にピンで固定しながら慎重に取り出します。

その後、PBSで洗浄します。続いて、4% Paraform aldehydeで30分間固定します。黒色のサードコートを施したペトリ皿上で各筋肉を解剖するため、虹彩切除用ハサミを用いて腱を取り除きます。

その後、内部の筋線維を剥離して筋肉を薄くします。終板帯を含む筋肉の外表面を慎重に維持してください。次に、得られた筋肉をVector Shieldを用いてプラススライドグラスに載せ、22 by 40 mmのガラスカバースリップで覆い、両側を透明なマニキュアで封止します。適切にスライドに固定されていれば、終板帯がカバースリップに接しているはずです。

これは、左後肢におけるその場（in situ）の圧挫部位の例です。圧挫部位はカーボンブラックで示されています。アスタリスクは、大腿筋群に支配を供給する脛骨神経の分枝を示しており、有用な指標となります。

圧挫手術において、坐骨神経の脛骨枝は青色、腓骨枝は緑色、そしてsrelは黄色で outlined されています。この半薄切片は、止血鉗子を用いて行われた完全な圧挫を示しています。矢印は、ここで圧挫した線維を示しています。

角度付き鉗子で不完全な圧挫を行った別のセミシン切片を示す。矢尻は再び圧挫した繊維を、矢印は保存された軸索を示している。これらは全層標本筋肉のレンダリング画像である。

結合組織を除去し、その後薄層化した後、各筋肉における神経終板帯を縁取りします。ここでは、坐骨神経挫滅から14日後の、下層全体の全層標本筋肉を示しています。

矢印は、軸索によって再神経支配された神経筋接合部の領域を示しています。ここでは、脱神経した神経筋接合部の実演を示します。矢じりは、GAP-43陽性のシュワン細胞突起を示しています。

この脱神経された神経筋接合部には、軸索が見られません。このビデオを視聴することで、静止神経を再現性よく挫滅させ、再生分析のための筋肉ホルモン標本を調製する方法について十分に理解できるはずです。