異なる系統にヒト胚性幹細胞（hESCの）の伝播との差別化のための3Dプラットフォームとしてのアルギン酸マイクロカプセル

本プロトコルは、ヒト多能性胚性幹細胞を3Dシステム内で封入し、ドーパミン作動性ニューロンへと分化させるために最適化されています。まず、コロニーをROCK阻害剤（RI）で処理し、単一細胞に解離させた後、アルギン酸ナトリウムと混合して封入デバイスに通します。RI処理を3日間継続し、封入された細胞をPA6細胞上に移して28日間分化させます。

最終的に、遺伝子およびタンパク質発現解析により、ドパミン作動性ニューロンの生成効率が向上することが示されました。既存の2D分化プロトコルに対する本手法の主な利点は、これらの細胞を3D環境下で増殖および分化させようとする点にあり、この3D環境によって細胞を高密度に増殖させることが可能になります。また、これにより分化に向けてより良好な細胞間相互作用を得る機会も提供されます。

そして第三に、その後の分化効率を向上させることができます。また、補足いたしますと、この手法は3D環境で増殖可能な他の種類の細胞にも応用可能です。なお、この手法は、細胞のアポトーシスを防ぎ、培養皿からの細胞の剥離を防止する特定のROCK阻害剤を用いて最適化されている点に留意してください。

一般的に、この手法に慣れていない方は、この技術が組織培養で通常行われるものではないため、最初は苦労されることでしょう。以下のカプセル化技術は、Dean博士とChad博士による、R阻害剤型アルギン酸の適用、アルギン酸濃度、およびカプセル化装置の設定に関する要約研究に基づいて最適化されています。それでは、当研究室の博士課程学生であるJamieとKimが、このプロトコルを実演します。

滅菌済みの50 mLチューブに入った275 mgの精製アルギン酸ナトリウムに、25 mLの滅菌済み0.1%ゼラチン溶液を加え、ボルテックスしてアルギン酸粉末を部分的に溶解させます。その後、チューブをオービタルミキサーに設置し、10 Gで一晩撹拌します。次に、アルギン酸溶液に9%滅菌塩化ナトリウムを加えます。

30秒間ボルテックスし、次いで95×gで5分間遠心分離します。アルギン酸溶液は4°Cで保存してください。まず暗所で、10 µMのROCK阻害剤を添加した培地を用いてヒト胚性幹細胞を前処理します。

37 °Cで2時間インキュベートします。次に、細胞を酵素的に剥離させるため、DPBSで2回洗浄します。Accutaneを添加し、10分間インキュベートします。

37 °Cで、セルスクレイパーを用いて細胞を穏やかに回収し、15 mLチューブに移します。等量のSL培地を加えてAccutaneを中和します。その後、中和した細胞を40 µmフィルターを通して、新しい50 mL遠心チューブに回収します。

次に、ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測します。遠心分離によって細胞をペレット化し、上清を注意深く除きます。その後、あらかじめ加温しておいた緩衝液で細胞を1回洗浄します。

0.9%塩化ナトリウム。遠心分離して上清を除きます。ヒト胚性幹細胞を封入するため、まず、あらかじめ温めておいたアルギン酸溶液で細胞を再懸濁します。

これを行うには、20 milliliter のシリンジを軟質プラスチックチューブに接続し、アルギン酸をシリンジ内に吸引します。次に、気泡が入らないように注意しながら、シリンジを用いて細胞懸濁液を穏やかに混合します。その後、細胞をシリンジ内に吸引します。

プラスチックチューブを廃棄し、シリンジをカプセル化装置に取り付けます。次に、ビーズジェネレーター、シリンジポンプ、エアフローメーター、および塩化カルシウム沈殿浴の装置セットアップを行います。カプセル化装置の末端からペトリ皿の回収点まで、10 centimeterの隙間があることを確認してください。

次に、シリンジポンプを10 milliliters per hourに設定します。空気流量を8 liters per minute、圧力を100 kilo pascalsに設定します。カプセル化された細胞を、あらかじめ温めておいた沈殿浴に7分間回収します。

その後、緩やかな吸引によって、20 mLの0.9% Sodium chlorideを含む50 mL遠心チューブに移行させます。カプセルをチューブの底に沈殿させ、上清を静かに除いた後、0.9% Sodium chlorideで一度洗浄します。続いて、ROCK阻害剤を添加し、あらかじめ温めておいた培養培地で封入細胞を再懸濁します。培養フラスコに移し、3日間インキュベートします。

マウス間質細胞株PA6を0.1%ゼラチンでコートしたT75フラスコに播種し、ドパミン作動性神経分化培地で24時間コンディショニングさせる。カプセルを50 mL遠心チューブに移し、チューブの底に沈殿させる。上清を捨て、PA6細胞でコンディショニングしたドパミン作動性神経分化培地でカプセルを再懸濁する。

培地培養。カプセル化したヒト胚性幹細胞をPA 6細胞単層とともに21日間培養します。培地を補充する際は、培地を交換してください。

毎回、培地の半分のみを交換し、PA 6細胞をドーパミン作動性神経分化で培養し続けます。誘導因子を添加した培地で1週間培養します。まず、カプセルを吸引し、15 mL遠心チューブに移します。

カプセルが底に沈殿したら、上清を捨てます。DPBSで2回洗浄し、その都度上清を捨ててください。その後、5 mLの脱被膜溶液を加え、懸濁液を十分に混合します。

室温で5分間インキュベートします。遠心分離してペレットを得た後、脱キャップ細胞をDPBSで2回洗浄し、これらの脱キャップ細胞を単層培養または直後のダウンストリーム解析に使用します。一般的な調製では、アルギン酸マイクロカプセルの直径は400〜500 µmとなります。

ここでは、CFDAPIアッセイを用います。結果から、80%の生存率における緑色の生存カプセル化細胞を判定します。異なる時点でのカプセル化ヒト胚性幹細胞の生存率、増殖、およびアポトーシスの解析は、培養条件の最適化に寄与します。興味深いことに、ROCK阻害剤の効果により、解離誘導性アポトーシスが抑制され、細胞生存能が維持されるとともに、HFCMにriを添加して培養したカプセル化ヒト胚性幹細胞で優れた増殖が認められました。

この例では、細胞封入を3Dプラットフォームとして適用し、封入されたヒト胚性幹細胞をドパミン作動性ニューロンへと分化させます。予想通り、胚体（embryo bodies）のサイズは時間の経過とともに増大し、脱封入後の細胞は、培養2〜3日後に進行性のニューロン形態を示し、生存率は90%を超えています。遺伝子発現解析では、多能性マーカーであるOCT fourのダウンレギュレーションが示されています。

重要な点として、神経前駆細胞マーカーであるPAC sixおよびドーパミン作動性ニューロンマーカーであるthは、分化後7日後も引き続き発現が亢進しています。さらに分化したヒト胚性幹細胞では、21日後に90%以上のTH陽性ニューロンが認められます。ウェスタンブロット解析により、2D細胞培養システムと比較して3DシステムにおいてTHおよびPAC sixの良好な発現パターンが示されました。

この手法を習得すれば、2時間で効率的に実施することが可能です。カプセル化の前後に、必ずROCK阻害剤を用いて細胞を処理してください。今後の実験に合わせて、分化誘導剤や阻害剤を変更することで、3D分化プロトコルを最適化できます。

この特定の技術は、ヒトESLを封入し、3D環境下で分化させること、あるいは多くの疾患、特にパーキンソン病に対する細胞療法の可能性を目的としています。