タリイメージベースのメ​​ーターを用いたGFPの発現と生存率の評価

このビデオでは、tally画像ベースサイトメーターを用いて、GFPを発現している細胞の生存率を決定する手順を解説します。GFP導入細胞をtally viability kit dead cell redで染色すると、プロピジウムイオダイド（PI）によりすべての死細胞が赤色に染色されます。これらの細胞をtally細胞分析スライドにピペッティングしてサイトメーターにロードすると、明視野像および赤色・緑色の蛍光画像が取得・解析されます。その後、従来のフローサイトメトリーと比較して、細胞数、細胞サイズ、PI蛍光強度、およびGFP蛍光強度を表示するヒストグラムが生成されます。

Taliでも細胞生存率や発現に関する同様のデータを得ることができます。しかし、この画像ベースのサイトメトリーは、解析対象となる細胞集団についてのさらなる視覚的情報を提供します。フローサイトメトリーや蛍光顕微鏡などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、Tali画像ベースサイトメーターが細胞サンプルの定量的情報と視覚的情報を同時に提供できる点にあります。

さらに、tally instrumentはフローサイトメーターや蛍光顕微鏡よりも使用が簡単で、低コストであり、設置面積も小さく済みます。これにより、研究者はGFP発現細胞の生存率などの定量アッセイを、ベンチトップで迅速に実施することが可能です。本手順では、1×10⁶ cells/mLの濃度のU2 OS細胞に、核移行性GFPウイルスコンストラクトを導入し、死細胞をプロピジウムイオジドで染色した後、細胞懸濁液100 µLを新しいマイクロ遠心チューブに移します。

アッセイには1×10⁵～1×10⁷ cells/mLの濃度が推奨されますが、濃度を厳密に合わせる必要はありません。次に、Tally Dead Cell Red試薬を1 µL添加します。その後、短時間ボルテックスして混合し、染色試薬と細胞の混合液を室温・暗所で1～5分間インキュベートします。

インキュベーション後、直ちにtallyイメージベースサイトメーターによる解析に進みます。tallyでは、本装置専用に設計された使い捨てプラスチック製細胞解析スライドを使用します。スライドをロードする際は、必ず端を持つようにしてください。

25 µLのサンプルを、半月形のサンプルロード領域のいずれかにゆっくりとピペッティングします。ここでは、染色されていない非導入のコントロール細胞をチャンバーAに、GFPを発現し染色された細胞をチャンバーBにロードします。GFP発現細胞の生存率アッセイを行うには、サイトメーターのホーム画面でG-F-P-R-F-Pをタッチします。すると右側にアッセイオプションが表示されるので、GFP plus viabilityを選択してください。

次に、装置からサンプルシリーズに名前を付けるかどうかの確認が表示されます。「name now」を押してください。その後、タッチスクリーンを使用してサンプルシリーズの名前を入力し、「save」を押すと、tally cytometerは自動的に測定画面へ進みます。

次に、バックグラウンド蛍光を測定するために、ここに見えるように測定画面の右下にあるバックグラウンドタブを押します。デフォルト設定では、9つの細胞視野がイメージングされるようになっています。ここで、コントロールサンプルが装置とは反対側を向くようにして、スライドが止まるまでローディングポートに挿入します。

新しい未染色の細胞コントロールを挿入する際、背景スクリーンのタッチプレスに力を加えないでください。スライドは自動的に装置内に引き込まれ、細胞のライブ画像が画面に表示されます。フォーカスノブを使用して、フォーカスを合わせながら細胞を適切な視野平面に移動させてください。

赤色のズームボタンを4倍または16倍にスライドさせます。細胞集団をより適切に観察するには、個々の細胞の周囲に明るいハローがあり、細胞自体が均一に暗く表示されている必要があります。ここで示すように、背景と細胞の縁との境界が曖昧で、細胞の輪郭が明確に定義されていない場合、細胞数が過小にカウントされることがあります。

細胞の中心部が明るく、外周部が暗い場合、過剰にカウントされる可能性があります。細胞にピントを合わせた後、「touch」または「press」を押し、未染色細胞コントロールを実行します。背景蛍光を測定するため、サイトメーターが自動的に画像をキャプチャし、各視野のサムネイルを表示します。

プログレスバーにより、解析の進捗状況が随時更新されます。画像キャプチャが完了すると、サイトメーターが自動的にスライドを排出（イジェクト）し、キャプチャされた画像の解析データを提供します。保存されたデータは、「background」タブのドロップダウンメニューに表示されます。

バックグラウンドコントロールサンプルには、実験に与えたものと同じ名前を割り当てます。PI染色したGFP導入サンプルを測定するには、装置からスライドを取り出し、向きを反転させて、導入サンプルが装置とは反対側を向くように再挿入します。サンプルタブを押し、「press」をタッチして新しいサンプルを挿入してください。

画面に画像が表示されたら、フォーカスノブを使用して細胞に焦点を合わせます。前と同様に、「Run Sample」をタッチして実行します。画像キャプチャが完了すると、解析データがサンプルタブに表示され、サイトメーターによってスライドが自動的に排出されます。

tally細胞解析スライドを廃棄します。これらはバイオハザード廃棄物であるため、再利用することはできません。サンプルの解析が完了すると、サンプルに閾値を適用できます。

ここでは、特定の細胞集団を分析するために、閾値を調整して生存細胞と死細胞の割合を決定します。「sample」タブにあるGFP発現細胞の項目では、GFPを発現している生存細胞の数と割合、GFPを発現している死細胞の数と割合、および総生存率が表示されます。また、平均細胞サイズ、カウントされた細胞数、および細胞濃度が表示されます。

さらに、画面下部には細胞サイズ、緑色蛍光、および赤色蛍光を示すヒストグラム・プロットが表示されます。細胞サイズのゲートを設定するには、細胞サイズのサムネイルをタッチして細胞サイズヒストグラムを開き、デブリを除去します。青色のスライダーバーを移動させて、サイズの大きすぎるイベントと小さすぎるイベントの両方を除外してください。

ゲート内に細胞を含めるために、「適用（apply）」をタッチします。次に、分析にGFP蛍光を追加するために、GFPヒストグラムのサムネイルをタッチして開きます。

青色のスライダーバーを移動させ、最も低いピークのすぐ右側に閾値を設定します。コントロールサンプルをガイドとして使用してください。これにより、自家蛍光細胞を除外しつつ、GFP陽性細胞を解析に含めることができます。

細胞内の生物学的分子が励起されると、しばしば自家蛍光が観察されます。確認して前の画面に戻ります。サンプルタブの下に表示されるデータには、両方の蛍光チャンネルに設定されたゲートとしきい値が反映されているはずです。次に、PI染色された細胞を自家蛍光やサンプル内に存在するバックグラウンドから分離するため、PIヒストグラムのサムネイルをもう一度押して開きます。

コントロールサンプルのピークは、ヒストグラム上にグレーのピークとして表示されます。赤色のピークはサンプルの蛍光を示します。背景蛍光は、本装置においてRFU値が0に最も近いピークとして表示されます。

PIチャンネルのバックグラウンド蛍光を除去するには、青色のスライダーバーを動かして閾値を調整します。このピークを除外する場合、コントロールサンプルのグレーのピークをリファレンスとして使用してください。PIチャンネルの閾値が適切に設定されたら、「apply（適用）」をタッチして確定し、前の画面に戻ります。すると、計数装置が再度データを自動的に再解析し、サンプルタブの結果を更新します。

次に、各細胞が適切に割り当てられていることを視覚的に確認するため、ズームタブを押し、確認したいキャプチャ視野のサムネイル画像を押して選択します。その後、レイヤータブを押します。続いて、GFPまたはPIボタンを押し、そのチャンネルを通じてキャプチャされた画像を表示させます。

同じボタンをもう一度押すと、ディスプレイからレイヤーが削除されます。レイヤーを重ね合わせるには、各チャンネルに対応するボタンをタッチして、特定のチャンネルを通じて細胞がどのようにカウントされるかを確認します。明視野チャンネルのみでカウントされた細胞、つまり蛍光を発現していない細胞は青い円で囲まれます。これは、特定の細胞がグリーンチャンネルで発現している生存細胞であることを示しています。

レッドチャンネルで発現しているGFP陽性の細胞は緑色の円で囲みます。PIで染色された細胞は赤色の円で囲み、死細胞として両方でカウントします。レッドチャンネルとグリーンチャンネルの両方で発現している細胞は黄色の円で囲みます。

これは、細胞がGFPを発現しているが、同時にPIで染色されており、したがって死細胞であることを示しています。時折、画面上に黒い円が表示されることがあります。これらは、識別されたものの、細胞サイズに基づいて解析から除外されたオブジェクトです。

先ほど説明した手順を用いて、蛍光ヒストグラムの閾値を微調整し、蛍光を発現しているすべての細胞が適切な色で囲まれるまで調整を続けます。すべての解析パラメータは、データタブの下に、装置に自動的に保存されます。

集計機能では、500回のサンプルランのデータファイルを保存できます。データタブに保存された各ファイルは、再解析が可能です。データタブからファイルを選択すると、そのファイルが再度開き、すべてのヒストグラムとレイヤーが有効になり、データのアーカイブやレポートの作成が行えます。

装置に保存されたデータは、USBドライブを使用してコンピュータに転送できます。4種類の代表的な細胞タイプに、核標的細胞光GFPウイルスコンストラクトを導入し、Dead Cell Red試薬を用いたTally Viability Kitで染色した後、ここに示すようにフローサイトメーターでTally解析を行いました。どちらの手法においても、各細胞タイプにおけるGFP発現細胞の割合、および生存しておりかつGFPを発現している細胞の全集団に対する割合について、ほぼ同様の結果が得られました。

これらのデータは、Taliサイトメーターが集団全体のGFP発現と生存細胞集団におけるGFP発現を区別できることを示しています。ここでは、Taliイメージベースサイトメーターを用いて、細胞サンプルの蛍光発現と生存率を評価する方法を実演しました。この技術は、個々の細胞研究と細胞集団研究の間の隔たりを埋めるものです。

tallyイメージベースサイトメーターを使用することで、個々の細胞およびより大きな細胞集団に関する定量的な視覚情報と定性的な視覚情報を収集できます。同様の手順を用いて、アポトーシス、RFP発現、細胞生存率を含む他のいくつかのアッセイを実施することが可能です。非発現細胞においては、遺伝子発現の評価から薬効研究に至るまで、幅広い応用が期待されます。