のサンプル調製

本手順の目的は、NMRメタボロミクスを用いて結核菌（mycobacterium tuberculosis）の細胞遊離抽出物を分析することです。まず、適切な増殖段階で培養および細胞の回収を行います。次に、細胞を溶解させて分析用の細胞遊離抽出物を取得します。最後に、凍結乾燥した抽出物をNMR分析用のバッファーで再懸濁します。

最後に、NMRデータを収集し、ソフトウェアを用いてスペクトルを解析して代謝物を同定します。最終的に、mycobacterium tuberculosisのNMR解析を用いて、さまざまな処理における代謝物レベルの保持を示します。NMRメタボロミクスは、重要な代謝経路など、mycobacterium tuberculosisの生理学的側面の主要な要素に適用できます。

この理解は、薬理作用および耐性のメカニズムを解明し、創薬のための新たな標的を特定する上で極めて重要です。一般的に、この手法に不慣れな人は、すべてのサンプルを完全に同一に扱うことが困難であり、それが不必要なばらつきを招き、当研究室における結果に影響を及ぼす可能性があります。大学院生のSteven Luka博士候補生が、NMR処理のためのサンプル取り扱い手順を実演します。続いて、当研究室のリサーチラボマネージャーと、リサーチテクニシャン3のRobert Fentonが、M tuberculosisを用いる際のMycobacterium tuberculosis培養物の取り扱い手順を実演します。

研究は施設ガイドラインで定義されたバイオセーフティーレベル3の慣行に従って行われました。バイオセーフティー上の考慮から、このビデオ内のラベルにはmicrobacterium tuberculosisと記載されていますが、このデモンストレーションでは非病原性のmycobacterium magmaticを使用しました。まず、M tuberculosisの50% glycerolストックを氷上で解凍することから始めてください。

0.15 mLを250 mLのエルレンマイヤーフラスコに入った110 mLのM-A-D-C-T-Wブロスに接種し、37 °Cで100 RPMで振盪しながら約6日間培養します。抗生物質、代替添加物、またはその他の処理が必要な場合は、処理が必要な培養物を回収します。

培養、力価測定、および品質管理用に、0.5 milliliter の Eloqua を氷上で確保します。次に、目的の処理を行い、処理時間が経過した後、培養物をシェーカーに戻します。1 milliliter を分取し、OD 600 を測定します。

また、培養、滴定、および品質管理用に0.5 milliliterのサンプルを分けておきます。以降のプロトコル全体を通して、細胞を氷上で保持してください。15 milliliterの氷冷2回蒸留水で洗浄した後、遠心分離により細胞を4本の50 milliliterチューブに回収します。

ペレットを10 mLずつ分注して懸濁させます。2本の分注液を取り出し、遠心分離によりペレット化させ、その後、細胞ペレットを最終容量1 mLの二回蒸留水に再懸濁します。凝集のない単一細胞懸濁液が必要な場合は、細胞を27Gの針に通してください。

1 mLの細胞懸濁液を、溶解マトリックスBを含む2 mLスクリューキャップチューブに3回に分けて移します。FastPrep-24ライシスホモジナイザーをバイオセーフティキャビネット内に設置します。サンプルをサンプルホルダーに入れ、保持スポークプレートで固定します。次に、速度設定6 m/sで60秒間処理します。

次に、サンプルを遠心分離して、細胞の残骸と生存細胞をペレット化します。その後、生存細胞が不在であることを確認するため、上清を0.2 micronのシリンジフィルターに通して滅菌チューブに回収します。サンプルの0.1 milliliterをMADC.Agarに塗布します。

サンプルをエタノール・ドライアイスバスで凍結し、凍結乾燥およびNMR施設での処理を行うまで-80 °Cで保存します。2か月後、プレートを確認し、コロニー形成単位（CFU）が存在しないことを検証します。CFUが認められない場合、サンプルをBSL3研究室から搬出し、標準的なNMR施設でさらなる解析を行うことができます。

サンプルを完全に乾燥させた後、0.7 millilitersのNMR緩衝液で再懸濁し、マイクロ遠心チューブに移して13,000 ×gで3分間遠心分離します。0.6 millilitersを分取し、5 mm NMRチューブに移します。メディア分析において、カスタムラックを使用することで、複数のNMRチューブを適切な深さまでスピナーにロードすることが容易になります。

次に、サンプルをNMR分光計に移動させ、A-B-A-C-S 20サンプルオートサンプラーにセットします。その際、未処理の培養液と薬剤処理した培養液を交互に配置します。最初のサンプルは、自動運転の開始時にあらかじめマグネット内にロードしておく必要があります。

装置を校正するために、単一のサンプルを用いて90度パルス幅を最適化し、残りのサンプルに向けて装置の調整を行ってください。icon NMRおよびgrad shimを使用します。各サンプルについて、ロッキング、シミング、およびNMRデータ収集を自動化してください。

1D ¹H NMRスペクトルの場合は、水抑制およびエキサイテーション・スカルプティング（excitation sculpting）を含むパルスシーケンスを選択します。2D ¹H-¹³C HSQCスペクトルの場合は、総データポイント数を32,000点、スキャン数を128回、ダミースキャン数を16回に設定します。パルスシーケンスを選択してください。

直接次元のH 1方向に掃引幅を持つデータポイントを合計2048点、間接次元のC 13方向に掃引幅を持つデータポイントを64点選択します。また、良好なS/N比を得るために、128回のスキャンと16回のダミースキャンでスペクトルを収集するように指定します。m tuberculosisのスペクトルでは、既知の代謝物50種を含む約400本のピークが生成されました。

例えば、付属の原稿に詳述されているデータ処理により、D アラニン経路に直接的または間接的に関連する代謝物のスペクトルが得られました。ピーク強度の大きさは細胞抽出物中に存在する代謝物濃度に比例するため、サンプル間および処理間で、代謝物および代謝経路の相対的な変動を定量化できます。LMRメタボロミクスは、細菌学分野の研究者が、視覚的かつ微小細菌的に、他の病原性または非病原性微生物の生理学および病原性を探索するための道を切り開くものです。

このビデオを視聴することで、NMRメタボロミクス用に複数の結核菌細胞抽出液を調製する方法を十分に理解し、さらに重要な点として、信頼性の高い結果を得るためにプロトコル全体を通じて一貫性を維持する方法を習得することができます。