xCELLigenceシステムにCR51リリースアッセイを比較することによって、人間Her2neu特異的CD8 T細胞の最適な細胞傷害活性を決定する

本実験の全体的な目的は、EXOGENシステムを用いたインピーダンスベースの手法とクロム放出試験を比較することにより、細胞傷害性T細胞の活性を決定することです。まず、フィコリンを用いて全血から末梢血単核細胞（PBMC）を分離します。次に、抗原特異的なCD8 T細胞を誘導するため、ペプチド抗原、ヒト組換えIL-2、および放射線照射PBMCとともに、PBMCをウェルに添加します。

その後、両方のアッセイにおいて、抗原特異的なCD8 T細胞を腫瘍細胞と共培養し、腫瘍細胞死を誘導します。インピーダンス法とクロム放出アッセイの両方を用いて、腫瘍細胞の溶解率の結果を得ます。クロム放出アッセイなどの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、インピーダンスベースのシステムがリアルタイムのデータを収集でき、さらに、ラベル化を必要としないより少量の細胞で済むことです。本プロトコルでは、メーカーのプロトコルに従い、正常で健康なHLA-A2陽性ドナーからの血液を、PBMC（末梢血単核球）のソースとして使用します。

F call PA plusを用いて、血液からP BMCを分離します。次に、6ウェルプレートの各ウェルに、2 mLの培地に含まれる約400万個のP BMCを分注します。各ウェルに、最終濃度が10 µg/mLとなるようにHLAA 2結合ペプチドを添加します。

T細胞の刺激および増殖を促すため、隔日で細胞を処理します。最終濃度が 50 units/mL となるように、ヒト組換え IL-2 を添加した新鮮な培地を加えます。1週間後、自己 pbmc の培養液を調製し、細胞を放射線照射した後、同一の hla で 2 時間パルスします。

10 µg/mLの2つの結合ペプチドを用い、照射した自己PBM CSを1 mLずつ加えることで、各培養物を再刺激します。1週間後、隔日にIL-2を添加した新鮮な培地を加え続け、同様の方法で2回目の再刺激を行います。さらに6日間培養した後、細胞が使用可能な状態になります。

インテリジェンス・インピーダンス測定ステーションを、5% 二酸化炭素条件下、37 °Cで1時間以上平衡化させ、使用準備を整えます。0.25% trypsimを用いて75% コンフルエントに達したヒト腫瘍細胞を回収し、遠心分離を行います。ヘモサイトメーターを用いて腫瘍細胞を計数し、RPMIで再懸濁します。

1 µLあたり7,500個の濃度の腫瘍細胞懸濁液を用います。次に、xCELLigenceエージェントソフトウェアで、ウェルレイアウトを含むレイアウトページを設定します。スケジュールページを設定し、40時間にわたって5分ごとにインピーダンス測定を行うようにします。最初の18時間は、xCELLigenceシステムは腫瘍細胞のインピーダンス測定のみを行います。

次に、1ウェルあたり100 µLのRPMI腫瘍培地を加えます。細胞がない状態でインピーダンスを測定し、EPLsのバックグラウンド値を測定します。腫瘍細胞を添加した後、プレートをステーションにセットし、測定を開始します。

腫瘍細胞はすぐにEPLへ接着し始めます。約18時間のインキュベーション後、腫瘍細胞はEPLに接着し、1ウェルあたり15,000個まで増殖します。この時点で、緩やかなスクレイピングと攪拌遠心により、調製済みのT細胞を回収します。

T細胞を10% FBS含有RPMI培地で再懸濁し、ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測します。細胞密度が判明したら、200 µLのT細胞を腫瘍細胞に加えた際に、最高濃度が腫瘍細胞1個あたり40個のT細胞となるように、T細胞の2倍希釈系列を調製します。この希釈系列の最終濃度は、腫瘍細胞1個あたり1.25個のT細胞となるようにします。

EXOGENステーションを一時停止し、ピペットを用いてEPLを除去します。ウェル内の培地を除去し、陰性対照として希釈系列のすべての濃度を用いたT細胞を200 µLずつ分注します。純粋な培地を用い、EPLをステーションに戻して、アッセイの終了時にプログラムを再開してください。

結果を標準化します。chromium 51およびchromium 51で標識した標的細胞を扱う際は、常に機関の放射線安全手順に従い、遮蔽物を使用して放射線曝露を低減してください。まず、腫瘍細胞を1 million cells/mLの密度で、10 µL/mLの新鮮なchromium 51を用いて2時間パルス標識します。

次に、腫瘍細胞を10% FBS含有RPMI培地10 mLで洗浄し、遠心分離した後、同培地を用いて1 mLあたり100万個の細胞濃度で再懸濁します。その後、96ウェル丸底プレートに、自発的な放出を算出するために、1ウェルあたり10万個の腫瘍細胞を分注します。

これらのウェルのうち6つと、別の6つのウェルには何も加えないでください。残りのすべてのウェルに、細胞を溶解させて最大放出量を算出するため、100 µLのTriton X 100を加えます。あらかじめ調製した希釈系列を用いて、プレートにT細胞を加えます。

次に、プレートを5時間インキュベートし、各ウェルから50 µLの上清サンプルを回収します。プレートをフード内で室温で一晩乾燥させた後、サンプルをlumaプレートにロードします。ガンマカウンターを用いてCPMを測定します。T細胞およびSKBR3癌細胞をxCELLigenceプレートで培養し、細胞インデックスを測定しました。T細胞は増殖に接着を必要としないため、細胞インデックスはプレートインピーダンスを反映しています。

40時間の培養において、それらがインピーダンスに及ぼす影響は無視できるものでした。がん細胞のみを培養した場合は、インピーダンス測定値の上昇が見られました。しかし、18時間後にT細胞を添加すると、この傾向は消失しました。

このイベントは、T細胞の添加後にソフトウェアによる正規化が必要であり、次回の実験でさらに詳しく検討します。SK BR 3細胞をさまざまな濃度のT細胞と共培養したところ、インピーダンスの低下はT細胞の用量に明確に依存していました。データは10時間時点で3回の試行にわたり5分ごとに収集されました。細胞指数はT細胞の濃度範囲において二次多項式に従っており、これはExogenステーションが、細胞指数の低下としてSK BR 3腫瘍のCD8 T細胞媒介性死滅をリアルタイムでモニタリングしていることを示しています。T細胞によるSK BR 3のインピーダンス低下が抗原特異的であるかを確認します。

SK-BR-3細胞を、HER2を認識しないHLA-A2陽性のFLU特異的T細胞とともに共培養しました。これらの細胞の溶菌活性は有意に低い結果となりました。HER2特異的T細胞が抗原特異的に殺傷しているかをさらに検証するため、共培養系にFasリガンドに対する抗体を添加しました。その結果、抗体を添加してもHER2 P360-9特異的T細胞の溶菌活性は低下しませんでした。

しかしながら、anti CD threeおよびCD 28ビーズで非特異的に活性化されたT細胞を用いた場合、抗体によって溶菌が抑制されたことから、細胞死がHLAクラスI依存的に起こっていることが判明しました。共培養系にanti HLAクラスI抗体またはアイソタイプコントロール抗体を添加したところ、その結果はこの仮説を強く支持するものでした。

次に、T細胞を他の癌細胞と1:5の比率で共培養しました。陰性対照として、HLA-A2陰性の腫瘍細胞株BT 20を使用しました。その結果、この手法が複数の標的接着性腫瘍細胞に有用であることが示されました。

HER 2つの新しいP 360 9特異的T細胞の共培養物を、クロム51標識標的細胞に添加し、続いてCRA分析を行った。このアッセイは、一貫性を分析する上でより感度が高いと考えられる。アッセイ内変動は、1:40から1:5までの各細胞比における変動係数（%）として算出した。

これは、最も低い細胞比において15%未満で測定されました。しかし、CV%は高く、または予測不可能なものでした。さらに、異なるP360.9特異的T細胞株との共培養によるSK-BR-3 T細胞溶解の変動性を検討しました。

データは30日おきに生成されました。アッセイは3連で実施され、結果は非常に類似していました。このビデオを視聴することで、インピーダンスベースの手法を用いて、抗原特異的CD8 T細胞と腫瘍細胞による細胞傷害性T細胞活性を決定する方法を十分に理解できるはずです。