表面プラズモン共鳴によるホストのサイトゾルへ毒素の転座の検出

この手順の全体的な目的は、細胞質に進入する毒素のプールを検出し、定量することです。これを達成するために、まず毒素を4 °Cで宿主細胞の表面に結合させます。次に、未結合の毒素を除去し、細胞を37 °Cに温めます。これにより、毒素が内膜系、そして続いて宿主の細胞質へと移動することが可能になります。細胞への浸透後、ジゴトニンを用いて細胞膜を選択的に透過させます。

最終ステップとして、分画遠心法を用いて細胞抽出物を膜画分と細胞質画分に分離します。表面プラズモン共鳴（SPR）を用い、抗毒素抗体をコートしたSPRセンサー上に細胞質画分を灌流させることで、細胞質への毒素の流入を検出し定量します。この手法は、細胞質への毒素流入の効率と速度論、細胞質に流入する毒素量、および細胞質への毒素輸送に対する薬剤による阻害の可能性など、毒素生物学分野における重要な疑問への回答に寄与します。本プロトコルの開始前に、HeLa細胞を一夜培養した後、書面プロトコルに従って細胞毒性試験のためのHeLa細胞を準備してください。

培養液を、100 ng/mLのGanglioside GM1を含むDMEM 1 mLに交換し、37 °Cで1時間インキュベートします。これにより、コレラ毒素の結合部位が増加します。これは、GM1溶液にさらされた細胞の細胞膜に、毒素のGM1受容体が挿入されるためです。

1時間インキュベートした後、培地を含むGM oneを除去し、DMEMで細胞を2回洗浄します。次に、1 µg/mLのコレラトキシンを含むDMEMを1 mL加え、細胞を4 °Cで30分間静置します。トキシン含有培地を除去し、細胞を2回洗浄します。

その後、細胞を1 mLのDMEM中で37 °Cで目的の時間インキュベートします。各チェイス期間の終了時に、細胞をPBSで洗浄し、各ウェルに250 µLの0.5 mM EDTAおよびPBSを加えてインキュベートします。氷上で10分間インキュベートした後、P1000ピペットマンを用いて激しくトリチュレーションを行い、6ウェルプレートから細胞を回収します。

1ウェル分の細胞を回収した後、同じ条件の2ウェル目、次いで3ウェル目の細胞と合わせてください。次に、3つの複製ウェルから合わせた細胞懸濁液を、1本のマイクロ遠心チューブに入れます。その後、卓上マイクロ遠心機を用いて、マイクロ遠心チューブを5分間遠心分離してください。

5,000 ×g で遠心分離し、すべての条件においてほぼ同サイズの細胞ペレットを得ます。上清を捨て、あらかじめ調製し冷却しておいた 0.04% digitonin 希釈液 100 µL で細胞ペレットを再懸濁します。細胞懸濁液を氷上で 10 分間静置し、卓上マイクロ遠心分離機を用いて 16,000 ×g で 10 分間遠心分離し、digitonin により透過化した細胞を回収します。

上清画分を含む細胞質液を新しいマイクロ遠心チューブに移し、オルガネラを含むペレット画分を回収します。SPRトキシン標準品は、HCN緩衝液を用いて110 ng/mL、1 ng/mL、および0.1 ng/mLの濃度で調製します。サンプルは、上清画分を含む細胞質液をHCN緩衝液で希釈し、最終容量を1 mLとして調製します。注入前に500 µLのサンプルループから空気を完全に除去するため、サンプル量は少なくとも1 mL必要です。オルガネラを含むペレット画分は、1% Triton X 100を含む1 mLのHCN緩衝液で再懸濁します。

膜に包まれた毒素プールを放出させるには、界面活性剤の添加が必要です。また、分画手順の正確性を確認するための対照実験として、細胞質画分とオルガネラ画分の並行セットを準備します。細胞質画分を20 µLの4倍サンプルバッファーに、オルガネラ画分を120 µLの1倍サンプルバッファーにそれぞれ再懸濁させ、各画分の等量をドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）で分離し、ウェスタンブロット解析によって、細胞質タンパク質が上清画分に、可溶性ER residentタンパク質がペレット画分に分配されていることを示します。SPRスライドを準備するには、まず自己組織化単分子膜を形成させた金メッキガラススライドをSPR装置にセットします。

41 µL/minの流速でE-D-C-N-H-S溶液を10分間灌流し、センサースライドを活性化させます。以降のすべての灌流では、同じ流速を使用します。0.05% Tween 20を含むPBSでプレートを5分間洗浄し、E-D-C-N-H-S活性化バッファーを除去します。

E-D-C-N-H-S溶液によるアンキャッピングにより、プレートには反応性MIテザーが含まれています。次に、20 mM酢酸ナトリウムで1:20,000に希釈した抗CTA抗体を、活性化させたセンサースライド上に15分間灌流します。pHの変化により、屈折率単位（RIUと略記）の初期低下が見られます。

続いて、アミド反応性テザーによって抗体が捕捉されるにつれ、RIUが増加します。センサースライド上の未結合の抗体を、5分間のPBST洗浄で除去します。捕捉された抗体によって生じたRIU信号はプラトーに達して安定し、新たなベースライン信号となります。

スライド調製を完了させるため、1 M エタノールアミンをセンサースライド上に5分間灌流します。これにより、センサースライド上に残った未結合のテザーがキャップされ、不活性化されます。RIU信号が増加してベースラインが確立されるため、抗体コート済みセンサーにPBSTを5分間灌流します。

次に、実験サンプルまたは毒素標準品をセンサー上に300秒間流します。バッファーからリガンドを除去し、さらに200秒間PBSTをセンサー上に流します。センサーに結合して残っている毒素は、pH 5.0のPBSTによる102回目の洗浄で除去されます。

これにより、信号が初期のベースライン読み取り値に戻り、同じセンサーで別のサンプルを処理できるようになります。新しいサンプルをロードする前に、少量の空気をサンプルループに通して、前のサンプルの残留液体を排出してください。データ収集後。

データはScrubber 2ソフトウェアで解析でき、図の作成にはIgorソフトウェアを使用できます。百日咳毒素はAB毒素であり、A鎖が細胞質に進入する前に、細胞表面から小胞体へと移動します。

SPRベースの転位アッセイにより、毒素に曝露したCHO細胞の細胞質内にPTsが検出されました。非曝露細胞の細胞質からはシグナルが生成されず、これにより抗PTsの特異性が確認されました。ある抗体は、ホスト細胞の細胞質成分と交差反応しませんでした。

felden存在下で中毒させた細胞から得られた細胞質画分。Aにおいても陽性シグナルの生成に失敗した。BFAは小胞体（ER）転位部位への毒素輸送を阻害し、その結果、H鎖の細胞質への配送を妨げる。Chole toinは、もう一つのAB型ER転位毒素である。

CT処理したhelo細胞の細胞質画分からCTA1が検出されました。これにより、本手法が複数の細胞タイプで機能し、アンチチェーン抗体が利用可能なあらゆる毒素に適用できることが強調されました。CT処理した細胞の細胞質画分をアンチCTB抗体でコーティングしたSPRセンサー上に流したところ、シグナルは検出されませんでした。したがって、CTA1サブユニットとは異なり、細胞結合性のCTBペンタマーは細胞質に侵入しないことが示されました。

抗CTA抗体でコーティングしたSPRセンサーへの注入後。細胞質画分からの弱いシグナルと比較して、オルガネラ画分からのシグナルはスケール外となっています。これは、ER転位部位へのCT輸送の効率が低いことが知られており、その結果として細胞質に到達できる毒素量が制限されることと一致しています。

転位した細胞質毒素の時間依存的な蓄積をモニタリングすることも可能です。4°Cで細胞をCTに曝露させた後、37°Cに加温して15分が経過した時点では、細胞質に毒素は検出されませんでした。

37°Cで30分後、少量の細胞質毒素が検出され、45分および60分のチェイス間隔後には、より多量の細胞質毒素が漸次的に検出されました。これは、細胞に結合した毒素が、宿主細胞の細胞質へ継続的に長期的に輸送されることを示しています。また、このアッセイでは、細胞質への毒素移行の阻害も検出可能です。10% DMSOで処理した細胞では、未処理の毒素投与コントロール細胞と比較して、細胞質様のCT1のレベルが低く、毒素のアンフォールディングが抑制されていることが示されました。

鎖状構造は細胞質への移行に不可欠であるため、DMSOによって誘導されたCT A1の安定化は、それに伴い小胞体（ER）から細胞質への移動を抑制した。DMSOによる毒素移行の阻害を定量化するため、既知濃度の毒素から作成した標準曲線を用いて細胞質内のCTA1濃度を算出した結果、未処理細胞では0.3 nanograms per milliliter、DMSO処理細胞では0.1 nanograms per milliliterであった。したがって、DMSOによるCT A1のアンフォールディングの抑制により、ERから細胞質へのCTA1の移行は3分の1に減少した。

この手順に従うことで、細胞質中に存在する毒素量と毒素活性との間の直接的な関連性を立証するために、中毒アッセイなどの他の手法を利用することが可能になります。