胎児性アルコール暴露のゼブラフィッシュモデルの催奇形性変化を評価する

この手順の全体的な目的は、ゼブラフィッシュの発生過程におけるエタノール曝露の影響を調べることです。まず、発生初期のゼブラフィッシュを、通常胚用水にエタノールを添加した溶液に曝露させます。次に、エタノールを除去し、目的の時点まで魚を成長させます。

次に、対照群の胚と比較して、処理した胚における肉眼的な形態的変化および遺伝子発現の変動をアッセイします。最後に、mRNA、モルフォリノ、または薬剤を用いて胚を操作し、エタノールによって誘発された発生欠損が変化するかどうかを判定します。最終的に、定量PCRとin situ ハイブリダイゼーションを組み合わせることで、発生中のゼブラフィッシュ胚に対するエタノールの影響が遺伝子発現の変化に関連していることが示されます。

その後、遺伝子発現レベルを操作することで、エタノール誘発性の発生異常を改善または防止できる可能性があります。本日実演する手法は、胎児性アルコール症候群の性質に関する知見を深めるだけでなく、脊椎動物における発生プロセスの保存性を探るものです。本日の実演は、私の研究室の技術者であるSteph Erhardtが行い、胚にエタノール処理を施します。

野生型の交配から胚を採取し、胚用飼育水中で28°Cにてドーム期まで育成します。1回の産卵で得られた胚を、1皿あたり10から50個になるようにして、目的の皿数に分注します。魚用飼育水で0.2から2.5% (v/v) に調整したエタノール溶液を胚に添加し、目的の曝露時間が経過した後、最大24時間までインキュベーターに戻します。

定量PCR用のmRNAを回収するため、発生の特定の期間において、水分を含むエタノールを新鮮な胚用海水に交換します。H matched胚をエッペンドルフチューブに入れます。魚の飼育水を除去し、TCEPを含む溶解バッファーを加えます。

電動パルバライザーを用いて胚を物理的に解離させ、その後、遠心機にかけて低速回転させます。溶質をプレクリアカラムに移し、カラムを遠心分離します。これにより、解離した大きな破片を除去します。

RNA抽出キットを用いてRNAを抽出します。次に、qPCRまたはマイクロアレイ解析のための標準的な手法を用いてcDNAを合成し、in situ ハイブリダイゼーションおよび抗体染色のための胚を準備します。受精後6～24時間の胚を4%パラホルムアルデヒドで4℃にて一晩固定し、その後、PBSおよび0.1%Tweenで3回洗浄します。

顕微鏡下で、2本の鋭いピンセットを用いて卵黄を除去します。次に、メタノールの濃度を上げ、PBTの濃度を下げる段階的な液置換を行い、胚をメタノールへと移行させます。胚を100% methanolに転送した後、軟骨を染色するために-20°Cで保存します。

受精後5〜6日目まで胚を育成します。4°Cの4%パラホルムアルデヒドで一晩固定します。その後、PBTで3回洗浄し、エタノール曝露によってどの遺伝子発現レベルが変化したかを決定します。

まずプライマーを設計し、その妥当性を検証してQPCRを実施します。3つの生物学的サンプルを用いてテストを行ってください。これらのコントロール用生物学的サンプルは、目的の遺伝子がその特定の年齢で発現しているのであれば、どの年齢のものでも構いません。

プライマーの検証が完了した後、 previously prepared CDNA を用いて QPCR を実施します。サンプルは 3 重（triplicate）で測定し、ゼブラフィッシュのコントロールサンプルとして gap dh 用のプライマーを使用したコントロールを含めます。結果を gap DH のレベルで標準化してください。その後、強力な計算手法を用いて遺伝子発現の相対レベルを算出します。

野生型に対する実験群の差を示す2つのdelta delta CTのバリエーション。Cは2つのハイブリダイゼーション構築物。目的遺伝子に対する標識リボプローブ。

次に、標準的な条件下で、同齢の胚と共にインキュベートし、アルカリホスファターゼを用いてハイブリダイゼーションパターンを検出します。解剖顕微鏡を用いてサンプルの画像を撮影し、体の形状などの形態形成上の発達を評価します。また、生体胚の画像を撮影し、眼間距離および体長を評価します。まず、胚をパラホルムアルデヒドで固定します。その後、画像を収集し、幼生期の染色において、アルコール処理が発達中の軟骨構造に及ぼす影響を検討します。

固定したゼブラフィッシュを、数時間から一晩、lcおよびblueを用いて処理し、イメージング前に胚を脱色・透明化します。生存胚における細胞死を解析するため、5 mg/mLのacridine orangeを含むPBS中で1時間インキュベートします。胚をPBSで3回洗浄し、スライドグラスにマウントした後、共焦点顕微鏡を用いてサンプルを撮影し、Zスタック画像を用いて複合画像を 作成します。

エタノール曝露により発現が低下した遺伝子を特定した後、目的遺伝子のキャップ付きmRNAを25〜200 pg/nLの濃度で1〜2細胞期の胚に注入します。卵を28 °Cの加熱インキュベーターでドーム期に達するまで回復させ、その後、前述と同様にエタノール処理を行います。エタノール曝露の結果として発現が増加した遺伝子については、アンチセンスモルフォリノをpgからng量まで1〜2細胞期の胚に注入し、ノックダウンを行います。

このプロトコルは、キャップ付きmRNAの場合と同様です。mRNAやスプライシングモルフォリノを注入する場合は、R-T-P-C-Rを用いて効率を測定し、スプライシングされた転写物とされていない転写物の量を比較して、用量依存的な遺伝子活性を解析してください。注入するモルフォリノの量を調整し、エタノールで処理する前に、胚を目的のステージまで成長させます。ゼブラフィッシュ胚をエタノールに曝露させると、他の脊椎動物に見られる表現型に関連した、多くの発育不全や遺伝的欠損が生じます。

Noorを含む軸組織の異常な発達は、noordの短縮や、時には断裂を引き起こし、それが結果として、ここで示されるようなその後の体節の異常へとつながります。未処理のコントロール群は強いシェブロン型を示しますが、エタノール処理を施した体節は、sonic hedgehogシグナルの低下で見られるようなU字型の外見を呈します。ここに示されている通りです。

エタノール曝露のもう一つの結果として、初期の発育遅延およびそれに続く神経欠損の下流で起こる可能性がある胚の全長短縮が認められます。この知見は、発達期にエタノールに曝露された子供に見られる思春期前状態の持続や低身長と同様であり、ゼブラフィッシュモデルがこのヒトの先天性欠損を理解する上で有用であることを示唆しています。動物モデルにおいて、重度のエタノール曝露は、シンシアやオピアを含む顕著な胎児性アルコール症候群の表現型を引き起こすことが実証されています。

ゼブラフィッシュにおいて、眼間距離（IOD）は、ヒトの先天性欠損の性質と一致するように、エタノール投与量に依存して減少します。眼球欠損（Opia）は非常に高用量でしか見られませんが、低用量でもIODの有意な減少が認められ、この動物モデルが正中顔面発達において同様の欠損を有していることが示唆されます。この図では、未処理の胚とエタノール処理した胚における six3B および glee1 の初期遺伝子発現レベルを比較しています。

エタノール処理したサンプルでは、両方の遺伝子ともに発現レベルの低下が認められました。NC 2ハイブリダイゼーションを用いて、six3BおよびgooIDの発現パターンを解析した結果が示されています。ここで、未処理のコントロールと比較して、エタノール処理した胚では両遺伝子の空間的発現が減少していることが示されました。

両方の遺伝子がC craniofacial midline組織になる予定の組織で発現しているため、受精後8時間におけるこれらの減少は、その後の発達過程におけるIODの減少と一致しています。エタノールによって影響を受ける遺伝子が特定されれば、その発現を増加または減少させるメカニズムが存在します。この例では、gli1レベルを上昇させるリガンドであるsonic hedgehogのmRNAを注入したところ、gli1の減少およびエタノール処理した胚による粗大形態的な欠陥が回復しました。

しかし、six three Bを注入しても、エタノール曝露による表現型を救出することはできませんでした。このビデオを視聴することで、発達中のゼブラフィッシュ胚においてエタノールによって引き起こされる遺伝的および発生的欠損をどのように調査するかについて、十分な理解が得られたはずです。ここで用いられた手法は、発達中の脊椎動物胚における他の水溶性化合物の毒性を研究したい場合にも適用可能です。