一酸化窒素の生物活性をアッセイするための分析手法

本実験の総合的な目的は、生物学的試料中の一酸化窒素代謝物を正確かつ特異的に検出する方法を実証することである。まず、採取直後に血液試料を処理することで、代謝物の消失やアーティファクトの形成を防ぐ。同時に、低酸素環境が一酸化窒素代謝物に及ぼす影響を最小限に抑えるため、迅速かつ効率的な組織採取を行う。

大動脈リングを採取し、器官浴に吊り下げて内皮機能を評価します。さらに、生化学的アッセイを用いて、組織内の硝酸塩レベル、亜硝酸塩レベル、ならびにニトロチオールおよびその他のニトロ化産物の相対レベルを定量します。これらのアッセイを用いて実験群と対照群の動物を適切に比較することで、一酸化窒素の生成と代謝に関する有用な情報を得ることができます。

単一の手法やアッセイよりもこのマルチシステムアプローチを用いる主な利点は、複数の器官系における一酸化窒素の生化学的状況をより広範に把握できる点にあります。これにより、これらの代謝物のうちどれに予後予測または診断上の有用性があるのか、また、一酸化窒素代謝物のレパートリーが内皮細胞での一酸化窒素の生成および利用可能性をどのように反映しているかを理解し始めることができます。プロセスの各ステップがサンプルの完全性を維持するために不可欠であるため、本手法を視覚的に実演することが極めて重要です。

一般的な学術誌のメソッドセクションを読んでも、サンプル収集や組織抽出の詳細な手順が十分に記載されていないことが多く、これらのステップを把握するのは困難です。本手順の実演は、私の研究室のシニアリサーチサイエンティストであるHong Jing博士が行います。本プロトコルのために、血液採取を行う人間または実験動物を用意してください。実験動物を使用する場合は、その後組織の検査も行います。

まず、25ゲージの針を下大静脈に挿入し、全血を採取します。500から1000 µLを採取した後、左心室心尖部から生理的緩衝液を注入して動物体内の残血を洗い流し、下大静脈から血液と緩衝液が流出することで完全に血液置換が行われるようにします。静脈血は、採取直後にNEMおよびEDTAを含む1.5 mL遠心チューブに回収してください。

遠心分離後、14,300 RCFで7分間スピンダウンします。ピペットを用いてRBCペレットから血漿を吸引し、別のチューブに移します。分離した血漿サンプルのHPLC用調製として、まず50 µLの回収血漿に、同 volumesの冷メタノールを加えます。

混合液が白濁するまで、3〜5秒間激しくボルテックスします。次に、14,300 RCFで7分間遠心分離します。血漿タンパク質を沈殿させるため、上清を別の1.5 mLチューブに回収し、分析まで4°Cで保存します。

化学発光分析用に血漿を調製するには、残りの血漿量（通常 200 〜 400 µL 程度）を2分量に分けます。血漿の半分に、5%酸性硫化物溶液を容量比10%添加し、10分間待機して調製します。これで、このサンプルはCLD分析に使用可能な状態になります。

5分後、2%塩化水銀を10%容量加え、血漿のもう一方の半分を調製します。室温にて、酸性化スルホンアミドを10%容量加えます。さらに10分間待ち、このサンプルを血漿と同様にCLDに注入します。

RBCペレットは、HPLCまたはCLDのいずれの分析にも使用して調製できます。まず、細胞ペレット1部に対して低張溶出液4部の割合で混合します。CLD分析の場合は、混合物を十分にボルテックスしてください。

細胞の調製は、血漿と同様に行います。まず、同量のメタノールを添加します。次に、混合物を3〜5秒間激しくボルテックスし、続いて14,300 RCFで7分間遠心分離します。

次に、上清をピペットで回収し、HPLCを用いて組織内の一酸化窒素代謝物レベルを分析するまで4 °Cで保存します。実験動物の目的組織を用いる場合は、まず前節に記載した方法で血液を採取し、調製してください。組織の採取は通常の方法で行いますが、組織が低酸素状態にならないよう、迅速かつ効率的に行うことに細心の注意を払ってください。採取後、組織サンプルをN-E-M-E-D-T-A含有PBSを用いて1:5の比率でホモジナイズします。

次に、赤血球（RBCs）について前述した手順に従い、ホモジナイズした組織をHPLCおよびCLD分析用に調製します。成マウスをジエチルエーテルで麻酔し、足指へのピンチ刺激に反応しないことを確認した後、開胸術を行います。胸骨から恥骨領域まで正中切開し、胸腔および腹腔を露出させます。

次に、酸素飽和Krebs Alite緩衝液で動物を灌流します。25ゲージの注射器を用いて、左心室の心尖部に緩衝液を注入します。この際、血液の排出路を確保するため、右心房を切開しておきます。

灌流後、肝臓、肺、および大動脈を覆っている可能性のあるその他の組織を切り取り、除去して、腹部大動脈を単離します。次に、ピンセットで心臓を保持し、動物の後壁から大動脈を丁寧に切り離します。心臓と大動脈を氷で満たしたペトリ皿に入れます。

ディッシュ内に冷えたKrebs緩衝液を入れます。大動脈から脂肪および外膜を慎重に切り取り、除去します。洗浄の際、血管内皮を傷つけないように注意してください。

5分ごとに新鮮な氷冷酸素飽和バッファーに交換し、大動脈の代謝を抑制して低酸素状態を防ぎます。次に、メスを用いて大動脈を3 mmの長さのリング状セグメントに切断します。これらのセグメントを、酸素飽和Krebsバッファーを満たした4チャンネル10 mL組織器官バスに移します。

トランスデューサーノブを使用して、各大動脈リングに1.5 gの予張力を加えます。経験的な知見に基づくと、血管運動機能を最適化するための適切な開始張力は1.5 gです。

マウスの張力測定を8チャンネルのオクタルブリッジとデータ収集ソフトウェアを用いてモニタリングおよび記録し、リングを80分間平衡化させます。その際、20分ごとに緩衝液を交換し、その後実験に進みます。組織の張力が平衡に達した後、各リングに100 nanomolarのフェニレフリンを添加し、最大下収縮を誘発させます。リングの張力が安定し、一定のトーンが維持されたところで、アセチルコリンなどの内皮作動薬を用いて用量反応分析を行います。

これにより、一酸化窒素の産生量と血管弛緩の程度を決定します。アセチルコリンに対する用量反応試験の後、バスをKrebs緩衝液で洗浄し、各臓器バスに100 nanomolarのフェニレフリンを添加して血管を収縮させます。その後、可溶性グアニル酸シクラーゼ阻害剤であるODQの有無において、ニトロプルシドナトリウムなどの外因性一酸化窒素源に対する平滑筋リングの反応性を決定します。

このアプローチにより、血管の100%弛緩値を決定するとともに、血管弛緩における一酸化窒素反応を媒介する可溶性グアニル酸シクラーゼの不可欠な性質を実証します。ODQはアセチルコリンに応答したナイトロプルシドによる弛緩を抑制するため、健康な対照マウスの大動脈リングは弛緩しましたが、内皮機能不全を持つマウスの大動脈リングでは、一酸化窒素産生の減少により弛緩が抑制されました。また、対照動物を用いて、亜硝酸塩の化学発光によるグループ特異的な脱ニトロシル化アッセイも実施しました。

還元脱ニトロシル化アッセイを用いて、RSNOおよびRNNOを検出しました。ピーク面積を差し引くことで、亜硝酸塩およびrSNOレベルを測定しました。この手法は、これらの一酸化窒素代謝物の血中レベルが組織レベルをどのように反映しているか、また、さまざまな疾患条件下で疾患代謝物がどのように変化するかなど、一酸化窒素および血管生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。

複数の器官系および単独個体の循環系全体において、これらの関連する一酸化窒素代謝物の定常状態濃度と半減期を決定することで、疾患プロセスの特異的な分子シグネチャーの特定が可能となり、一酸化窒素に基づいた新しい治療法の定義に寄与します。これにより、臨床医は疾患の重症度や進行に関するより優れたバイオマーカーを備えることができるようになります。一般的に、一酸化窒素研究の分野に不慣れな個人は、生物学的試料に含まれるこれら低レベルの一酸化窒素代謝物を検出および定量するのに十分な感度を持つ手法が少ないため、困難に直面します。さらに、技術に習熟していない者が試料処理を行うと、アーチファクトが発生しやすく、それが誤ったデータやデータの誤解釈につながる可能性が高くなります。