放射性その場でハイブリダイゼーション

本実験の全体的な目的は、特定の遺伝子発現領域を特定し、遺伝子発現のタイミングとレベルを明らかにすることで、遺伝子機能の理解に寄与することです。これは、組織の完全性を維持するために、手順に使用する組織を迅速に採取し、調製することによって達成されます。第二のステップとして、リボプローブのバックグラウンド結合を低減させるために組織処理を行います。

次に、リボプローブを組織にハイブリダイズさせ、RIBAプローブの結合を可視化します。X線フィルムまたは感光乳剤を用いることで、X線画像や暗視野および明視野顕微鏡観察と解析に基づき、遺伝子発現の部位とレベルを示す結果が得られます。Image Jソフトウェアを使用して解析を行います。ここでは、多くの人が間違いを犯しやすい、適切に行う必要がある重要なステップがいくつかあり、その一つがバックグラウンドの抑制です。

不適切なサチュレーションや、不適切な温度でのハイブリダイゼーションなど、バックグラウンドの原因となるステップがいくつかあります。また、RNAプローブを分解させるRNA汚染も要因となります。したがって、すべてをRNaseフリーな状態に保つよう注意する必要があります。

3点目は、スライドをエマルションに浸す際、暗室内に漏光がないこと、および最大3週間に及ぶ全工程を通じてエマルションを光にさらさないようにすることです。本手法の実演は、私の研究室のポストドクであるHun Chenが行います。新鮮な脳を採取し、1×PBSで洗浄した後、室温でメディアを入れた型に脳を浸し、OCT組織包埋剤で包埋します。

脳が切片作成に適した方向を向いていることを確認します。次に、ドライアイスにエタノールをスプレーし、ブロックをエタノールとドライアイスの混合物に入れて組織を凍結させます。エタノールがブロック内部に入らないように注意しながら、クライオスタットを用いて凍結組織を10〜12 µmの厚さで切片し、脳および胚組織用のSuper Plusスライドに貼付します。

最適な切削温度は-18°Cから-20°Cの範囲内です。切片はスライドボックスに入れ、-80°Cで保存してください。スライドを-80°Cの保存状態からドライアイス上のメタルラックへ移します。

次に、認証済みのドラフトチャンバー内で、室温より3〜5°C高く予熱した4%パラホルムアルデヒド溶液にラックを浸します。室温で5分間インキュベートした後、ラックをパラホルムアルデヒドから取り出し、ラックをPBSに15回浸してスライドを洗浄します。この洗浄ステップを、毎回新しいPBS溶液を用いて2回繰り返します。

次に、RIBAプローブの非特異的結合を低減させるため、スライドを調製したばかりのアセチル化バッファーに10分間浸します。その後、前と同様にスライドを洗浄しますが、今回は洗浄液として2×SSPEを使用します。70%、95%、100%のエタノール系列で各溶液に2分間ずつ浸し、組織を脱水します。

その後、ドラフト内でスライドを少なくとも10～15分間乾燥させます。書面によるプロトコルの指示に従ってRIBAプローブを合成した後、すべてのスライドに必要なRIBAプローブとハイブリダイゼーション溶液の必要量を算出します。Riboプローブハイブリダイゼーションミックスを65 °Cで5分間予熱します。

Riboプローブを変性させるため、Riboプローブハイブリダイゼーション溶液を100 µLピペッティングし、カバーガラス全体に配置します。次に、2枚目のガラスカバースリップを使用して、組織とカバーガラスの上に溶液を均一に広げます。スライドを水平に、表面を上にしてメタルラックに配置し、すべてのスライドの準備が整ったら、ラックを65 °Cのオイルバスにゆっくりと浸し、最低4時間、最大16時間保持します。

オイルは、インキュベーション後のカバーガラスの周囲に気密シールを形成します。スライドが入ったメタルラックから余分なオイルを取り除きます。その後、ドラフトチャンバー内でクロロホルムを入れたガラス製または金属製のトレーにラックを浸します。新しいクロロホルムを入れた2つ目のトレーで洗浄を繰り返します。

次に、ラックを0.1% $\beta$-mercaptoethanol含有2$\times$SSPE溶液に浸し、カバーグラスを外し、過剰なハイブリダイゼーション溶液を溶解させます。その後、スライドを新しく調製した0.1% $\beta$-mercaptoethanol含有2$\times$SSPE溶液に移します。カバーグラスを外したスライドを、0.1% $\beta$-mercaptoethanol含有2$\times$SSPEを含むトレイ内の新しいラックに移し、室温で1時間インキュベートして、結合しなかった過剰なRNAプローブを除去します。

次に、スライドラックを65°Cに予熱した2×SSPE（50% フォームアミド、β-ME、および最終濃度0.1%のエタノールを含む）に転移し、65°Cで1時間インキュベートします。インキュベーション後、この溶液およびそれまでのすべての水性洗浄溶液、ならびにカバーガラスを放射性廃棄物として廃棄します。続いて、65°Cに予熱した0.1×SSPEで、各30分間、スライドを2回洗浄します。

次に、組織を70%、95%、100%のエタノール系列でそれぞれ2分間脱水します。最後に、ドラフトチャンバー内でスライドを少なくとも30分間乾燥させます。まず、組織に放射性シグナルが存在するかどうかを確認します。

暗室にてセーフライトを使用し、乾燥させたスライドをフィルムカセットに入れます。スライドの上にX線フィルムを重ねます。スライドがフィルムのエマルション面に向いていることを確認し、カセットを閉じます。転写物の想定される量に応じて、スライドをフィルムに1日から7日間露光させます。

露光完了後、標準的な現像液および定着液を用いてX線フィルムを現像します。ハイブリダイゼーションシグナルは、細胞解像度を決定し、組織上のシグナルを確認するために、乳剤中の露光された銀粒子に起因してフィルム上に黒い領域として現れます。スライドを写真用乳剤に浸した後、対比染色を行います。

スライドをクリスタルバイオレットで対比染色する場合は、記載されたプロトコルの指示に従って切片を脱パラフィン処理しなければなりません。この時点で、暗室にて試験管に蒸留水を注ぎます。NTBエマルジョンをすくい取り、蒸留水を用いて1対1の割合で希釈します。

エマルションを42 °Cの恒温水槽で20〜30分間加熱して融解させた後、42 °Cの恒温水槽に浸したガラス製の浸漬容器に移します。希釈したエマルションの液量は、スライドを浸した際にスライド上のすべての切片を覆う程度にします。スライドの枚数が多い場合は、追加のエマルションが必要になることがあります。

次に、42 °Cの水槽内でスライドを希釈乳剤に浸し、その後、暗室内の密閉された遮光容器で一晩、または37 °Cのオーブン内で消灯状態で2～3時間、浸漬したスライドを乾燥させます。乾燥後、スライドをスライドボックスに移します。端を黒色の絶縁テープで密封し、さらにアルミホイルで覆います。

ボックスを4 °Cで数日間から数週間保存します。現像の準備ができたら、スライドを室温に戻します。次に、暗室でスライドが入ったラックをボックスから取り出し、16 °CのCodec D-19現像液で3〜5分間現像します。その後、現像したスライドを室温の水道水で1分間洗浄します。

次に、スライドを19°Cの定着液で6分間ずつ2回定着させます。2回目の定着中は室灯をつけても構いません。その後、室温の流水でスライドを30分以上洗浄します。続いて、スライドが濡れているうちに、カミソリの刃を使用してスライド背面からエマルジョンを削り取ります。

最後に、0.3%クリスタルバイオレットで対比染色し、必要に応じて書面によるプロトコルの指示に従って脱水およびスライドの封入を行います。さらに、スライドの裏面に付着した過剰なエマルションを、水で濡らしてカミソリで削り取ることで除去します。スライドを80%エタノール溶液で洗浄し、ゴミや埃を取り除くために1〜2回優しく拭き取ります。

暗視野照明または明視野照明下で撮影を行います。解剖顕微鏡の暗視野ではダスト粒子が容易に確認できるため、粒子がない良好な画像を得るには、スクレイピングとクリーニングの工程を2～3回繰り返す必要がある場合があります。以下の画像は、X線フィルムを用いたin situハイブリダイゼーションのオートラジオグラフィーの例です。

このX線フィルム画像は、胚発生10日目のキンカチョウの頭部全体の矢状断面を示しており、Fox P oneに対するアンチセンスリボプローブでハイブリダイゼーションが行われています。フィルム上の黒い感光粒子はメッセンジャーRNAの発現を示しており、脳内においてFox P oneメッセンジャーRNAが中隔線条体および背側視床に集積していることが確認できます。こちらのX線フィルム画像は、同じキンカチョウの個体でCuperに対するアンチセンスリボプローブを用いてハイブリダイゼーションを行った断面を示しています。

TF2は、視床背側およびより腹側の視床に濃縮されています。以下の画像は、エマルジョン浸漬スライドを用いたin situハイブリダイゼーションのオートラジオグラフィーの例です。解剖顕微鏡下で撮影されたこの暗視野画像は、Fox P1に対するアンチセンスRIBAプローブでハイブリダイズさせた、孵化後6日目のキンカチョウの頭部矢状断全 sectionを示しています。

組織上の乳剤層に見られる白い露出した銀粒子は、messenger RNAの発現を示しています。赤色はクレシルバイオレット染色の結果を表しています。スケールバーは1 mmを示しています。

ここにある画像は、coop TF twoに対するアンチセンスリボプローブを用いてハイブリダイゼーションを行った、同一のキンカチョウの切片を示しています。以下の画像は、胚齢12日のキンカチョウの頭部切片をX線フィルムでオートラジオグラフィーにより観察し、アンチセンス標識とセンス標識で異なるパターンが示されていることを比較したものです。破線は全脳の輪郭を、Cは小脳を示しています。

PAC sixのアンチセンス鎖は、脳、特に心室帯で発現していることがわかります。この隣接切片をPAC sixのセンス鎖でハイブリダイゼーションさせたところ、胚の頭部全体にバックグラウンド発現は見られませんでしたが、アンチセンス鎖と同様に網膜の色素層に明らかな発現が認められました。以下の画像Cには、胚後期におけるキンカチョウの脳から作製した、明視野および暗視野による2つの遺伝子発現シグナルと乳剤浸漬スライドを示します。

この明視野像は、胚齢10日目におけるD one Bの発現を示しています。乳剤への通常の露光では、黒く現れるラベルはこの倍率ではほとんど見えません。この画像は、前の画像と同じ切片および倍率のものですが、暗視野像に切り替えており、線条体と視床におけるラベルが白く示されています。

この明視野像は、胚齢12日目におけるslit threeの発現を示しています。エマルションへの過剰露光後、黒いラベルが容易に確認できます。SCは脊髄の位置を、CBは小脳の位置を示しています。

吻側は左方向を向いています。ここに示されている画像は同一の切片であり、倍率も同じですが、暗視野像に切り替えて表示しており、明視野像と一致する脊髄内の標識が白く示されています。以下の画像は、細胞レベルでの銀粒子の解像度を示しています。

ここに示すのは、キンカチョウ前脳におけるFox P1メッセンジャーRNAの標識です。シルバーグレインは、クリスタルバイオレットで染色された細胞上の黒い点として現れています。この画像は、成鳥キンカチョウの中側核（mesoalium）の個々の細胞における高発現を示しています。また、こちらの画像は、同一切片の隣接する側核（alium）の個々の細胞における低発現を示しています。

Hi Fox P1 メッセンジャーRNAの細胞における発現は、胚発生12日目の中胚葉に認められます。

ここで見られる胚細胞は、前の2つの画像に見られた成体細胞と比較して小さく、より密集しています。最後に、この画像は、同じ切片の隣接する外層（alium）の細胞における低発現を示しています。この手順に従うことで、標的遺伝子がどの細胞型で発現しているかなど、さらなる疑問を解決するために免疫化学などの他の手法を行うことができます。

このビデオを視聴することで、in situ ハイブリダイゼーションの手法について十分に理解できるはずです。放射性試薬の取り扱いは非常に危険であるため、この手順の間は常に個人用保護具などの予防策を講じることを忘れないでください。