アッセイのメソッドショウジョウバエ行動

本手順の全体的な目的は、ショウジョウバエの運動感覚および協調行動を調べる方法を実証することです。これは、まずクロールアッセイを用いて幼虫の運動機能を評価し、次にリングアッセイを用いて成虫の運動機能を評価し、さらに求愛アッセイによって成虫の協調性と感覚能力を評価することによって達成されます。最終的に、これらの一連の行動アッセイを用いることで、遺伝的要因や薬物治療などの外部要因が活動や協調性にどのような影響を与えるかを示すことができます。

Intra sophala。負のジオアクシスなどの既存の手法に対するこのアッセイの主な利点は、リングアッセイの方がスループットが高く、感度が優れていることです。この手法は、運動機能欠損の早期検出など、神経変性疾患分野における重要な課題の解決に寄与します。

このアッセイの実演は、私の研究室のポストドクターであるJamie Becknell博士が行います。幼虫の這行性アッセイは、運動能に対する遺伝的および環境的要因の影響を測定するために使用されます。まず、標準ボトルにオス10〜15匹と未交配のメス10〜15匹を合わせて交配させます。24時間後には、健康な成虫が十分な卵を産下し、ボトル内を幼虫で満たして、集団の齢を24時間に揃えることができます。

成虫を新しいボトルに移し、この工程を繰り返します。次に、餌の中に3齢幼虫が観察されるまでボトルをインキュベートします。20% sucroseを50〜100 mL加え、20分間静置します。

幼虫は水面に浮いてきます。先端をカットした25 milliliterのセロロジカルピペットを用いて幼虫を回収し、メッシュバスケットに入れます。メッシュバスケットに入った幼虫を脱イオン水で2回洗浄します。これで、実験に使用可能な状態になります。

薬剤で幼虫を処理するには、ブラシを用いて所定数の幼虫を、5% sucroseと目的の薬剤を含む5 mLのビーカーに移動させます。薬剤を含む糖溶液を15分間摂取させた後、メッシュバスケットを通して幼虫を戻し、洗浄してから、運動性に対する薬剤の効果の測定に進みます。ブラシを用いて個々の幼虫を、2% agarを含む15 cmのペトリ皿に移動させます。

方眼紙の上にセットします。次に、データを収集します。1分間に溶岩が通過した格子線の数を単純に数えてください。

次に、解剖顕微鏡下で、刷毛を用いて幼虫を希釈酵母ペースト溶液が入ったガラス解剖皿のウェルへと1分間かけて移し、Percyの収縮回数をカウントします。1回の収縮は、後方から前方への完全な1回の動作としてカウントします。目的の数の幼虫がカウントされるまで、この操作を繰り返します。

リングプロトコルを用いて、成体動物の移動速度を測定します。軽度の麻酔下で羽化したばかりの成体雄フライを回収し、通常食または薬物含有食が入った標準的なバイアルに移します。1バイアルあたり約25匹のフライを投入してください。麻酔から完全に回復させ、薬物濃度を定常状態にするため、フライを室温で2〜3日間維持します。

その後、麻酔をかけない状態で約25匹のハエをモールドプラグ付きのポリスチレンバイアルに移し、バイアルを1つ以上のリング装置に組み立てます。デジタルカメラをバイアルの側面から撮影できるように調整し、タイマーを準備してアッセイの希望時間に設定している間、ハエを15〜20分間休ませます。通常、アッセイの実施時間は3秒間です。

ショウジョウバエを驚かせないように、片手でリング装置を保持し、もう一方の手でカメラのタイマーをしっかりと保持します。ベンチ上で装置を3回軽く叩いてハエをダウンさせると同時に、カメラのカウントダウンタイマーを開始します。この試験を1分ごとに繰り返し、5〜6回の試行を行います。

初期データセットを収集した後のポリスチレン製試験バイアルを再利用しないことが極めて重要です。使用済みのバイアルに新しいハエを入れた場合、新品のバイアルに入れたハエと同程度まで登らないためです。画像ビューアを用いてデータを収集し、グループごとの平均登高をスコア化してください。

このアッセイでは、十分な数の子世代が得られるように準備されたボトル内の遺伝交配個体が必要となります。動物の主観的な夜明けから数時間以内に、3〜4時間おきにボトルをクリアしてすべての成虫を回収します。羽化したばかりの、交配経験のないオスとメスを回収し、オスは個別にフードを入れたバイアルまたはチューブに、メスは5〜6匹のグループに分けて飼育します。

同様の飼育容器において、アッセイには同数の雄と雌が必要です。採集したハエを5日間隔離した後、交配ホイールへの導入準備を行い、アッセイを実施します。次に、解剖顕微鏡下で、雌1匹と雄1匹を慎重に交配ホイールのチャンバーへ移します。

ペアを10分間、またはその間に交尾が成功するまで観察します。いくつかの行動について、それぞれが初めて観察された時間を記録します。オスが初めてメスの方を向いた時間を記録してください。

オスが脚でメスに最初に触れたとき、オスが最初に翅を広げて振動させたとき、オスがメスの生殖器を最初に舐めたとき、オスが最初に腹部を自分の下に丸めたとき、それぞれ記録します。オスがメスへのマウントを最初に試みたときも記録してください。最後に、交尾が起こるまで求愛行動に従事していた合計時間を記録します。

野生型動物の場合、これはほぼ常に5〜10分以内であり、3つの異なるパラメータでデータを収集します。第一に、行動への潜時とは、その行動が最初に観察されるまでに要した時間のことです。第二に、行動の頻度とは、その行動が観察されたかどうかを指します。

そして3つ目に、求愛指数とは、動物を用いた実験において、求愛に費やした時間を総時間および交尾までの時間で除したものです。筋萎縮性側索硬化症に関連するF-U-S-T-L-Sに突然変異を持つ個体において、挿入変異を持つ遺伝子変異体は、野生型対照群（左）の半分の這行能力を示し、R 5 21 Cミスセンス変異では這行速度がわずか約1 cm/minまで低下しました。

若齢の野生型成体ショウジョウバエを用いたリングテストの結果、平均高さは3秒間で3〜5 cmの登攀距離でした。このアッセイでは、リングアッセイの試行において1分間隔で最大5回連続で試行しても、脱感作は観察されませんでした。タイミングに関しては、可能な限り正確に行うことが重要です。

習熟すれば、適切に行うことで1つの遺伝子型につき10回の試行を観察する幼虫過密アッセイは30分から40分で完了させることができます。このビデオを視聴することで、ショウジョウバエにおける求愛行動の観察方法とスコアリングについても十分に理解できるはずです。