ITS2データベース

内部転写スペーサー2リボソーム遺伝子（ITS2）は、分子系統学において最も重要なマーカーの一つです。過去20年間の研究は主に、系統構築のためのITS2配列の活用に焦点を当ててきました。しかし、いくつかの理由から、ITS2の二次構造が系統推定の分野でますます利用されるようになっています。

二次構造解析を行うことで、このマーカーの分類学的な適用範囲を広げることができます。一方で、急速に進化し、そのため変動性の非常に高いITS2配列は、主に種レベルまたはそれ以下の系統解析に適しています。ITS2の二次構造は、4つの特徴的なステム（stem）からなり、強く保存されているため、構造情報を加えることで、より高い分類階級での解析を同時に行うことが可能になります。したがって、二次構造解析による結果は、一次配列から得られる系統的な解像度を向上させることができます。

同僚の皆様、こんにちは。Matthias Wolfと申します。私は約8年にわたりI ts two proofに従事してきました。現在はドイツのヴュルツブルク大学バイオセンターのバイオインフォマティクス部門で研究を行っております。

本日は、ITS2データベースの使用方法についての短い動画をご紹介します。こんにちは、y Chuです。この動画を作成した理由は、ITS2データベースが単なる保存用のデータベースではなく、系統解析を向上させるための多くのツールも提供しているためです。

この動画では、これらのツールの操作方法と、それらすべてをどのように連携させるかについて解説します。正確な ITS2 配列の境界決定は、構造予測において極めて重要です。そのため、隠れマルコフモデルに基づいたアノテーションを行うためのウェブベースのインターフェースが実装されました。

ITS2配列を正しくアノテーションするためには、ウェブサイト上部の配列エディターに配列をペーストしてください。ここでは例として、プランのサンプル配列をロードして示します。配列エディターは、ITS2配列が有効であるかどうかを自動的にチェックし、エラーメッセージを出力します。

例えば、非PAC文字を使用する場合、適切なHMMを選択した後、「annotate」をクリックしてプロセスを開始できます。プログラムによって特定された各5.8 sおよび28 SRNAが除去され、その間に位置する正しくアノテーションされたITS2配列が残ります。その結果、区切られたITS2配列と、予測された5.8 sおよび28 S-R-R-N-Aのハイブリッドが表示されます。新たに保持されたITS2配列のアノテーション後、HMMアノテーションの正確性を確認するために、2つの方法で二次構造を決定できます。

最初の予測は、データベースにある完全な配列および構造セットをテンプレートとして用いたホモロジーモデリングによって行うことができます。アノテーション済みである2つの配列の構造を予測するには、[構造予測]をクリックしてください。もし、右側の2つの配列が典型的な2次構造に直接折りたたまれることが可能であれば、その結果が即座に表示されます。

シーケンス構造をさらに処理するためのいくつかのオプションを選択でき、データプールへの追加も可能です。ここで2つのシーケンスが直接フォールドできない場合は、データベースに対するBLAST検索が実行されます。結果ページには、各プラスチックのテンプレートとして使用されるホモロジーモデリングを含む、最適なBLASTヒットが表示されます。

プラス記号をクリックすると詳細が表示されます。任意の配列構造ペアを選択し、ドラッグ＆ドロップまたは右クリックのコンテキストメニューを使用してデータプールに追加できます。もう一つの方法は、1つまたは複数の配列とその二次構造を手動で入力してテンプレートとし、クエリ配列に最適な二次構造を転移させる方法です。これは、複数テンプレートの例ファイルを読み込むことで実演されます。

「Predict best templates」をクリックすると、デフォルト設定でホモロジーモデリングが実行されます。ホモロジーモデリングプログラムがすべての構造に対して相互に計算を行い、最適なクエリテンプレートの組み合わせを表示します。結果のテーブルで、どのテンプレートが二次構造を用いて1つまたは複数のクエリ配列のモデリングに成功したかを確認できます。

繰り返しになりますが、完全なホモロジーモデリングアプローチはITS2に依存しないため、プラス記号をクリックすることで結果の詳細を開くことができます。この手法は、構造が既知である相同分子がある場合に、あらゆるRNAの二次構造を予測するために使用可能です。また、得られた配列・構造ペアは、ドラッグ＆ドロップまたは右クリックで開くコンテキストメニューからデータプールに追加できます。

I TS 2については、全体の構造に加えて、第3ヘリックスの頂点前に位置するA-U-G-G-U配列などの保存されたモチーフや、第2ヘリックスにおけるミスマッチ部位のピリミジン-ピリミジン構造が報告されています。このUUミスマッチは2つのモチーフに囲まれており、1つはヘリックス2の左側に、もう1つはヘリックス2と3の間の右側に位置し、さらに3つの連続したAヌクレオチドが存在します。これらの配列モチーフをHMM（隠マルコフモデル）に変換したことで、目的の配列内におけるこれらのモチーフの同定が可能になりました。

これらのモチーフを検索するには、検索フィールドにクエリ配列を入力し、適切なモデルを選択してください。ここでも、プラン用の例ファイルを読み込むことで手順を実演します。計算を開始するには、[motive search]をクリックしてください。

ITS2の2つのモチーフが、クエリ配列内で注釈付けおよびハイライト表示されています。ITS2データベースから2つの配列構造ペアを取得する方法の一つに、検索機能があります。この機能を使用すると、ユーザーは分類群名またはGenBank識別子のいずれかによって配列構造を検索できます。

GenBank識別子で配列構造を検索するには、検索フィールドにGIを入力して検索をクリックします。ヒットしたリストが新しいタブに表示されます。[詳細を表示]をクリックすると、配列構造の詳細を確認できます。

また、「show sequence structure per drag and drop」をクリックするか、右クリックのコンテキストメニューを介して、タブ内のすべてのヒット項目のS方向の配列を表示させることができます。選択した配列構造をデータプールに追加することも可能です。giによる配列構造ペアの検索に加えて、検索フィールドに分類群名を入力することもでき、これは表示されるライブ検索ボックスによってサポートされています。すべてのヒット項目がリストされた新しいタブが表示された後、以前と同様の機能にアクセスできます。

例えば、ドラッグ＆ドロップによってデータプールに選択項目を追加することなどが挙げられます。データベースから配列構造ペアを抽出する2つ目の方法は、ブラウズ機能です。ここでは、テキストが分類されています。

NCBIタクソノミーデータベースによれば、データはツリー構造を通じてアクセス可能です。ウェブサイトの左側に表示されており、プラス記号をクリックすることで、その一段下の階層を表示させることができます。

分類群名をクリックすると、その分類群の各配列構造のペアが含まれる新しいタブが開きます。CEMバンク識別子または種情報を用いた配列および構造の検索に加え、I Ts twoデータベースはBLASTに基づいた検索機能も提供しています。ただし、標準的なBLASTの手順では、遠縁の種を同定できないことが頻繁にあります。

配列の多様性が高いため、2つの配列が存在します。この障害を克服するために、ホモロジー検索に高度に保存された構造に関する情報を含めた、配列および構造ベースのblast検索を実装しました。これは、配列構造を12文字の擬似タンパク質配列に変換することによって行われます。

このように、関心のある任意の配列から開始し、広範な分類学的範囲をカバーする種のサンプリングは、BLAST検索を行うのと同じくらい簡単になりました。BLAST検索を実行するには、クエリ配列を配列エディターに入力してください。

クエリ配列が構造を持たない単純なヌクレオチド配列である場合は、二次構造を含む配列に使用される一般的なblastnアルゴリズムが使用されます。ウェブインターフェースでは、I Ts two blastアルゴリズムが使用されています。「blast」をクリックしてプロセスを開始してください。

しばらくすると、BLASTのヒット結果が新しいタブに表示されます。ここでは、クエリ配列ごとに1つのタブが表示されます。「show alignments（アライメントを表示）」をクリックすると、BLASTアライメントをスクロールして確認できます。先ほどと同様に、任意の配列構造ペアを選択してデータプールに追加することが可能です。

ITS twoデータベースでの作業中、データプールに複数の配列構造が蓄積されることがあります。データプールにはいつでもアクセスでき、その内容を表示することが可能です。解析の次のステップは、多重配列構造アライメントです。

「analyze dataset」をクリックし、次に「sequence and structure」を選択して、配列構造アライメントを実行します。ここで、アライメントのグラフィックモードを選択します。大量の配列セットを扱う場合は、「slim」バージョンを選択することが推奨されます。

データプールに含まれる配列構造が少ないため、フルグラフィックモードを選択します。計算が完了すると、アライメントがデータプールに追加されます。塩基対の一方をハイライトすると、対になる方が自動的にハイライトされます。

最後に、「safe alignment」をクリックしてアライメントを確定させます。配列構造アライメントの品質に満足したら、「analyze data set」をクリックし、次に「neighbor joining」を選択することで、系統的近接結合法による樹状図を算出できます。得られた樹状図は新しいタブに表示されます。

スクロールバーを使用して系統樹のスケールを自由に変更できます。また、系統樹の任意のノードまたは葉をクリックして「このノードでルートを再設定する」を選択することで、ルートの変更が可能です。データプールからタクソンを削除したい場合は、該当する葉をクリックし、「このノードをプールから削除する」を選択してください。

「safe tree」をクリックすることで、タクソンサンプリング数を減らしてアライメントと系統樹を再計算できます。系統樹はNU形式で保存可能です。「about this website」から「tools」をクリックすると、販売されているスタンドアロンツールおよびPro Sに関する詳細情報を確認できます。

ITS2データベースのウェブインターフェースで提供されている近隣結合法によるアライメント機能に加えて、現在は相補的変化に基づく種の識別制限など、いくつかの新機能を利用することができます。ここでは、系統解析を向上させるためのいくつかの手法を紹介します。ITS2データベースからデータを収集し、four cellを用いてアライメントを行い、最終的にProSで系統樹を算出する方法を説明しました。これらのすべてのステップにおいて、単に配列だけでなく、配列と構造の両方を考慮しました。

私たちの短い動画と、大がかりな系統樹の作成をお楽しみいただけたなら幸いです。それでは、おやすみなさい。