単純ヘルペスウイルスの待ち時間と再活性化の研究の主ニューロン培養システム

この実験の目的は、単純ヘルペスウイルスの潜伏感染および再活性化の研究に、一次神経細胞培養系をどのように利用できるかを示すことです。まず、ラット胚から上頸神経節ニューロンを単離し、非神経細胞を除去した後に解離神経節から単離したニューロンを培養します。次に、溶細胞複製抑制剤の存在下でEGFPウイルスを用いてニューロンに感染させ、HSVの潜伏感染を確立させます。

次のステップは、潜伏感染させた培養細胞の再活性化を誘導することです。最後に、EGFPの発現を経時的にモニタリングすることで、再活性化の効率を評価します。最終的に、化学阻害剤、RNA干渉、および遺伝子導入を用いることで、異なる神経細胞のシグナリング経路が単純ヘルペスウイルスの潜伏および再活性化をどのように制御しているかを示す結果を得ることができます。

この手法の既存の手法に対する主な利点は、宿主ニューロンにおける単純ヘルペスウイルスの潜伏を制御する相互作用を、分子レベルで詳細に研究できることです。この方法は、潜在的なゲノムを抑制するシグナルは何であるか、また、再活性化が分子レベルでどのように誘発されるかといった、単純ヘルペスウイルスの潜伏分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。ニューロンにおいて、この手法はHSV-1の潜伏に関する知見を提供できます。

本手法は、他の神経親和性アルファヘルペスウイルスにも適用可能です。手順のデモンストレーションを行うのは、当研究室の大学院生であるmarigo, KochiおよびJulian Kimです。本プロトコルで使用する上頸神経節（SCG）ニューロンは、妊娠した雌ラットの子宮から取り出した胚齢21日（E 21）のラット幼仔から単離します。解剖フード内で、ハサミを肩のすぐ上の首の付け根に当てて頭部を胴体から切り離し、各幼仔を安楽死させます。神経節を露出させるため、23ゲージの針を用いて、頭部を首側が上になるように3箇所で固定します。

まず、脊髄をピンで固定します。次に、鼻にかかる前方皮膚を引っ張り、ピンで固定します。そして3番目に、食道と気管を項部から離してピンで固定します。頸動脈分岐部を確認することで、SCGを探します。

頸動脈は対の構造です。頸部の両側に2つの分岐点があるため、個体あたり2つのSCGが存在します。SCGは分岐点の直下に位置しています。

2つの端を持って分叉部を広げ、SCGを動脈から分離します。SCGは、分叉部を囲む不透明な黄色の脂肪組織に比べて半透明で無色です。神経節を12 millilitersのL 15に入れます。

15 mLのコニカルチューブに入れ、氷上に置いたグルコース添加培地。すべてのSCGを胚から回収し、慎重に取り出した後、神経節を600 RPMで1分間遠心分離し、余分な培地を除去する。

神経節を、トリプシンおよびコラゲナーゼを含む1 mLのL 15培地に懸濁させる。37 °Cで24分間インキュベートする。

8分ごとに撹拌します。次に、10 mLの海水培地を加え、トリプシンを不活化させるため1分間遠心分離します。600 RPMで、トリプシン・コラゲナーゼ培地を可能な限り除去し、10 mLのC培地を用いて1分間600 RPMで遠心分離し、神経節を洗浄します。

この洗浄を1回繰り返します。洗浄液を除去し、神経節を1 mLのC mediumに再懸濁させ、5 mLシリンジに取り付けた21ゲージの針を用いて、最大15回の上下往復動作でトリチュレーションを行い、解離させます。塊の大部分が解離するまで、23ゲージの針を用いてトリチュレーションを完了させます。

解離させたニューロンを70 micronのナイロンフィルターでろ過し、50 milliliterコニカルチューブに回収することで、残っている細胞の凝集塊を除去します。ろ過後の細胞懸濁液から10 microliter分を分注し、trypan blueを混合して生存細胞数を測定します。ヘモサイトメーターを用いて、色素を排除している細胞数をカウントしてください。

次に、コラーゲンとラミニンをあらかじめコーティングした96ウェル組織培養プレートの各ウェルに、50 ng/mLの神経成長因子を含むCメディア100 µLを用いて、生細胞を5,000〜6,000個分分注します。37 °Cで一晩インキュベートし、翌日（in vitro 1日目またはDIV 1）に、ニューロンが適切に接着しているか、および一部の軸索突起が伸長しているかを確認します。

ウェルのC培地を、NGF、Acho、および5-フルオロウリジン・2-デオキシウリジンを含む50 µLの神経基底培地（NBM）に交換します。細胞が乾燥しないよう、1行ずつ培地を交換してください。その後、培養物を37 °Cで5日間インキュベートします。

非神経細胞の死滅と神経細胞の成長を確認するため、毎日培養状態を観察します。in vitro 6日目にこの手順を開始する際は、非神経系の支持細胞の大部分が除去されていることを確認してください。常に、神経細胞への不要な物理的操作を最小限に抑えることが極めて重要です。

培地の除去と交換は非常に緩やかに行う必要があります。さもなければ、それによって生じる機械的ストレスがニューロンの生存率に影響を及ぼす可能性があります。各ウェルの既存の培地に、aciclovirまたはコントロールウイルス（CV）を最終濃度100 micromolarになるように添加します。翌日に機械的な力が細胞に悪影響を与えないよう、CVはゆっくりと慎重に添加してください。

DIV 7に、感染多重度（MOI）1〜2で、ウイルス溶菌タンパク質US 11に融合させたEGFレポーターを発現する組換え型HSV 1をSCG培養細胞に感染させます。希釈したウイルスをウェル内の既存培地に直接添加してください。擬似感染コントロールと溶菌感染コントロールを設けます。

CVを含まない培地でのポジティブコントロール。37 °Cで2〜3時間、感染を進行させます。次に、感染培地をNGFとCVを含む新鮮なNBMに交換します。感染培地を交換する際は、非常に慎重に行うことが重要です。プレートを自分側に傾け、ウェルの底からゆっくりと培地を取り除いてください。

次に、ピペットの先端をウェルの底ではなく壁面に向け、培地が細胞上にゆっくりと流れ落ちるようにします。細胞の乾燥を防ぐため、培地の交換は1列ずつ行ってください。HSV 1の潜伏感染を維持する能力を損なわないよう、できるだけ丁寧に扱いながら、培養物をインキュベーターに戻します。

培養物を37 °Cで6日間維持し、その間にウイルスを潜伏させます。この期間中、蛍光顕微鏡を用いてus 11 EGFPの発現をモニタリングし、溶菌性複製の指標とします。

予想通り、擬似感染コントロールではGFPの発現は見られないはずです。S 11 EGFPは感染個体でのみ検出される必要があります。CV処理を行わなかったポジティブコントロールウェルでは、一次感染の成功と効率的な溶菌サイクルによる複製が示されます。

DIV 14における再活性化を評価するために、CVを含む培地を、前回と同様にCVを含まない新鮮な培地に注意深く置換します。ピペットのチップをウェルの底ではなく壁面に向け、必要に応じて培地が細胞の上に緩やかに流れ落ちるようにします。20 micromolarのLY 2 9 0 0 4などの薬理学的または生物学的な変数を加えます。

A CV処理した潜伏感染培養物では、GFPの発現が検出されないはずです。細胞を37°Cに戻し、5〜6日間保持します。蛍光顕微鏡を用いて生存培養物を観察し、再活性化が起こっているニューロンを検出します。

再活性化頻度は、EGFP陽性ニューロンを含むウェルの数を数え、それをサンプルウェルの総数に対する割合として算出します。この図は、再活性化の既知の誘導剤であるトリガースタチンを、感染後のSCG培養細胞に適用した例を示しています。薬剤処理後5日間にわたり、蛍光顕微鏡を用いて毎日再活性化をモニタリングし、スコア化しました。

TSAを用いた場合、再活性化は2日以内に最大値の50%に達し、5日目までには60%に達します。DMSOで示されるベースラインまたは自発的な再活性化は、本実験における処理対照群の培養細胞では約10%であり、このin vitroシステムでは通常5～20%の範囲となります。感染後のSCG培養細胞の後半段階においても、LY 2 9 0 0 4による処理が行われました。

LYによって再活性化を誘導した培養細胞を、ウイルスDNA合成阻害剤であるホスホノ酢酸（PAA）で処理した細胞、および図に示すようにこれら2つの化合物を併用して処理した細胞と比較しました。LY 2 9 4 0 0 2で再活性化を誘導した培養細胞において、US 11 EGFPの発現がPAAによって阻害されており、US 11 EGFPの発現がウイルスDNA複製に依存していることが示されました。この手順を行う際は、無菌操作に細心の注意を払い、ストレスや機械的な刺激による自発的な再活性化の増加を避けるため、CG培養細胞を可能な限り慎重に扱うことが重要です。この手順に従って培養ニューロンにHSV oneの潜伏感染を成立させた後、S-H-R-N-Aによるノックダウンや、野生型および変異型遺伝子の異所性発現などの他の手法を用いることで、HSV oneの潜伏と再活性化を制御するニューロン機能を特性解析することが可能です。

HSV-1はBSL-2の安全対策を必要とするヒト病原体であることを忘れないでください。本手順を行う前に、BSL-2条件下での操作に習熟しておく必要があります。このビデオを視聴することで、潜在性HSV-1感染を確立するためのSCG培養の構築方法と、ニューロンにおける効果的な再活性化誘導方法について十分に理解できるはずです。