回転壁容器バイオリアクター由来3D上皮細胞モデルの培養とその応用

この非従来型のプロトコルでは、ヒトの生体内組織を再現する器官型3Dモデルへとヒト上皮細胞を培養するための、簡便で堅牢なシステムを提示します。まず、上皮細胞を組織培養フラスコ内でコンフルエントな単層になるまで培養して回収し、STLVバイオリアクター内でマイクロキャリアビーズと混合します。プラットフォーム上でSTLVを回転させて低流体剪断力の一定な自由落下環境を作り出すことで、細胞をビーズに接着・増殖させ、96時間後およびその後はおよそ1日ごとに細胞凝集体を形成させます。

凝集体の形成後、細胞代謝を維持するためにSDLVの培地を補充します。凝集体の形成と細胞分化が完了した後は、週に一度、光学顕微鏡で試料の画像を撮影し、分化の進行状況をモニターします。得られた凝集体を、後続の実験的解析およびアッセイのために播種します。最終的に、このシステムを用いることで、多種多様な科学的研究に適した、生体内に近い臓器様モデルシステムを構築することが可能です。

従来の細胞培養などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、上皮細胞が分化し、組織のような凝集塊として極性を持つため、形態学的および機能的に実際の人組織と同様に振る舞うことです。この3Dモデルシステムは、上皮細胞の生物学、宿主と病原体の相互作用、およびシステムに導入される可能性のある細胞種間の複雑な相互作用について、さらなる知見を提供します。Dr.Andrea Radkey。

私の研究室のポストドクターが、低回転横方向血管バイオリアクターの除染手順について実演します。開放ポートをルアーキャップで塞ぎます。STLVに95% ethanolを満たし、24時間平衡化させます。

エタノールを除去した後、滅菌蒸留水で満たし、ベンダー提供のツールを用いて24時間インキュベートします。すべてのネジを緩め、STLVからセンタープラグを取り出します。これらを滅菌ポーチに入れ、110 °Cで20分間オートクレーブします。STLVを再組み立てし、滅菌性を確保するために除染を繰り返します。

次に、STLVのネジを締めます。各ポートに、滅菌済みのワンウェイ止水栓を取り付けます。次に、10 mLおよび5 mLのルアーロックシリンジからプランジャーを取り外し、プランジャーを包装紙の中で保管します。

無菌状態を維持するため、シリンジをストップコックにねじ込みます。STLVが満たされ、5 mLシリンジに充填され始めるまで、10 mLシリンジにDPBSを注入してください。その後、各シリンジに滅菌プランジャーを挿入し、シリンジのプランジャーを交互に操作して、バイオリアクター内の残存気泡を除去します。

ストップコックを閉じ、STLVを回転式垂直プラットフォームに取り付けます。50 milliliterのコニカルチューブ内で漏れがないか確認するため、最低24時間回転させます。15 millilitersのDPBSを250 milligramsのcytodex microcarビーズに加え、冷却後にオートクレーブ処理を行います。

上皮細胞用の培養液でDPBS洗浄を3回行います。チューブを回旋させてビーズを再懸濁させます。その後、15 millilitersの培養液でビーズを再懸濁します。

まず、1×10⁷個の上皮細胞を組織培養フラスコ内で単層培養します。細胞を回収して計数し、トリパンブルー排除染色により細胞生存率を決定します。その後、準備したビーズに細胞を添加します。

すべての細胞を回収するため、コニカルチューブを洗浄します。次に、STLVからDPBSとシリンジを取り除きます。また、10 mLセロロジカルピペットを使用して、センターポートからプラグを取り除きます。

上皮細胞ビーズ懸濁液をSTLVにロードします。円錐チューブを一度すすぎ、すべての細胞とビーズを移行させます。その後、センターポートプラグを元に戻します。

次に、5 mLと10 mLのシリンジからプランジャーを取り出し、プランジャーを包装紙の中に置いておきます。無菌状態を維持するため、シリンジのポートにオープンストップコックを取り付け、締め込みます。STLVに培地を満たします。

プランジャーを交換し、ストップコックを閉じます。次に、新しく播種したSTLV培養液を37 °Cのインキュベーター内で、回転させずに30分間平衡化させます。インキュベーターからSTLVを取り出した後、ストップコックを開きます。

プランジャーを使用して気泡を取り除き、ストップコックを閉じます。次に、インキュベーター内でSTLVを20 RPMの連続回転に設定します。96〜120時間後、シリンジを取り外し、STLV内のビーズと細胞を沈降させるために両方のストップコックを開いて、培地を交換します。

細胞が定着したら、シリンジを用いてサイドポートから培地の約75%を抜き取り、給餌プロトコルを行います。その後も、細胞の代謝状況に応じて、必要に応じて培地を補充し続けてください。また、5〜7日ごとに凝集体の増殖と生存率をモニタリングします。

凝集体のせん断を避けるため、先端から約2 cmをカットして滅菌した1000 µLピペットチップを使用します。センターポートから凝集体を200 µL慎重に回収し、1.5 mLチューブ2本に分注します。分注した一方のサンプルを用いて細胞生存率をモニタリングします。ビーズから細胞を分離させた後、トリパンブルー排除法により生存率を評価してください。

細胞凝集体のイメージングのための染色。0.5から1 mLの培地を2つ目の1.5 mLの凝集体分注量に加え、カットオフチップを用いて小型ペトリ皿に移します。1000 µLピペットチップを用いて凝集体をイメージングします。

一部の上皮細胞モデルで倒立光学的顕微鏡を使用する場合、凝集体の回収約1週間前に、培養の通気性を高めるために凝集体を使い捨てのハーフ（容器）に移行させる必要があります。分析を行う際は、STLVからシリンジを取り外し、サイドポートから培地の約50%を捨てます。センタープラグを取り外し、中央ポートからすべての内容物を50 milliliterのコニカルチューブに慎重に注いでください。

STLVを5 mLの培地で2回すすぎ、すすぎ液を回収した凝集塊と合わせます。次に、凝集塊を50 mLコニカルチューブからHarvに移動します。1週間後、分化したヒト上皮凝集塊がSTLVバイオリアクターシステムで育成されたため、潜在的なアッセイ形式、アッセイおよび分析に向けて慎重に凝集塊を回収します。

SEMおよびTEM画像は、STLVで39日間培養したヒト腟細胞から収集したものである。3D凝集体は組織と同様の超微細構造的特徴を示しており、微小隆起、陥入、細胞内分泌小胞、および頂端面のマイクロヴィリが確認できる。3D腟細胞の共焦点免疫蛍光顕微鏡画像は、ムチンおよび上皮細胞と終末分化に特異的なマーカーの発現を示している。これらの生理学的に適切な表現型は、化合物の毒性を評価するための優れたプラットフォームとしても機能する。

細胞の生存率、代謝、または増殖を測定するために一般的に用いられるMTTアッセイは、さまざまな化学物質や化合物の毒性を測定するために使用できます。あるいは、トリパンブルー排除法により、試験化合物の処理後の毒性を測定することも可能です。本例では、NONOXINOL nineによる処理後、膣凝集塊は子宮頸部外植モデルと同様の毒性反応を示しましたが、単層培養とは異なるプロファイルを示しました。

これらの3D凝集塊は機能的な応答性を示します。例えば、 Toll様受容体によって認識される微生物由来の分子による刺激を受けると、凝集塊は応答し、IL-6タンパク質を含む前炎症性サイトカインを分泌し、プロゲステロン受容体の転写産物を発現します。また、腟細胞においてホルモン刺激に応答する受容体も観察されます。

これらの3D凝集塊は、病原体やホルモン分子に反応する能力を持つだけでなく、単純ヘルペスウイルス2型（HSV-2）の感染を機能的にサポートすることも可能です。HSV-2に感染した3D腟凝集塊の共焦点顕微鏡画像により、感染が確認されます。また、凝集塊内の個々の細胞の物理的および機能的特性は、フローサイトメトリーによって定量化することができ、例えば、個々の腟細胞におけるMUC1の表面発現を測定するためのフローサイトメトリーアッセイなどが挙げられます。

3D膣凝集塊は、単層培養での分化後と比較して、表面におけるMuc1の発現率が低いことが示されました。この手法により、組織生物学および感染症分野の研究者は、構造や刺激に対する生理学的反応を研究することが可能になりました。これらの器官型モデルを用いることで、ヒトの生物学的特性をより正確に再現することができます。