小型げっ歯類における膀胱内圧測定の使用：膀胱Chemosensationの研究

本手順の目的は、化学化合物が膀胱の貯尿および排尿機能に及ぼす影響を判定することである。まず、膀胱にカテーテルを留置する。短期間の回復時間を置いた後、カテーテルを介してコントロール溶液を30分間注入する。

さらに30分間にわたって膀胱内圧と排尿量を記録しながら、目的の化合物を動物に注入します。最終的に、排尿頻度の分析を通じて、刺激性化学物質が排尿パターンにどのような影響を与えるかを示すことができます。この手法の既存の方法（孤立膀胱の収縮能の記録など）に対する主な利点は、より生理的な条件下でこの器官の機能を研究できることです。

例えば、中枢神経系の調節作用は維持されます。この手法の視覚的な実演は極めて重要です。なぜなら、実験を成功させるためには観察すべき多くの技術的な詳細や操作があり、手術の手順を習得するのが困難だからです。まず、膀胱に留置するチューブを準備するために、PE 50チューブを希望の長さにカットし、メインのカテーテル上に18ゲージカテーテルの小さな白い断片を被せます。

次に、チューブの端を火で炙って小さなカフを作成し、生理食塩水でフラッシュして空気を抜きます。ここで、10～12週齢の雌ラットにイソフルランで麻酔を導入します。麻酔導入後、イソフルランの維持濃度を設定します。

動物を仰臥位に固定し、10 cc シリンジで作製した小型の麻酔マスクを装着させます。腹部を剃毛し、真皮を消毒した後、手術に進みます。以下の手術手順は、ラットとマウスの両方において同様に行われます。

まず、下腹部正中切開を行い、膀胱を露出させます。次に、手術において最も重要な工程に入ります。手術用顕微鏡下で、非吸収性モノフィラメント 6-0 縫合糸を用いて、膀胱頂に巾着縫合を施します。

次に、針を用いて、パースストリング（巾着縫合）の内側に小さな嚢窓切開を行います。この穴からカフ付きPE 50カテーテルを挿入します。PE 10のようなより細いカテーテルチューブは、抵抗が高く変動しやすいため、推奨されません。

サージカルノットを用いて、チューブの周囲にピューアースリング（袋縫い）を固定します。次に、カフ付きの先端が縫合部の直下に来るまで、カテーテルをゆっくりと外側に引きます。漏れを防ぐため、18ゲージのカテーテル片を縫合部に向かって押し込みます。

カテーテルと膀胱の間に漏れがないか確認します。生理食塩水を緩やかに注入し、漏れがある場合は追加の縫合で締め付けます。

次に、切開部位の上部にカテーテルのための通路を残しながら、モノフィラメント縫合糸を用いて腹筋を閉鎖します。動物がチューブを噛むのを防ぐため、中空の金属棒を使用してカテーテルを肩甲骨間領域までトンネルさせます。手術後、金属棒は皮膚の下かつ腹筋および背筋の上に配置してください。

ロッドを動物の皮下を通して肩甲骨間領域まで押し込みます。非吸収性モノフィラメント縫合糸で腹筋と皮膚を閉鎖し、手術を完了させます。ここで、生理食塩水でフラッシングを行い、留置したカテーテルの開通性と安定性を確認することが非常に重要です。

注入液が膀胱から尿道へと流出することを確認します。鎮痛剤を皮下投与した後、カテーテルの外端をプラスチックフィルムで密閉し、ラットの下背部の皮膚にカテーテルを固定します。最後に、動物を30分間休ませて回復させます。

サイトメトリーを開始する前に、装置が適切に校正されていることを確認してください。デジタル天秤の上に置かれたオイル入りの容器の上に、代謝ケージに入れたラットを配置します。次のステップは、留置カテーテルをルアースタブを介して三方活栓に接続することです。

タップを圧力変換器と輸液ポンプに接続します。圧力変換器はアンプを介してデータ収集システムに接続され、一般に公開されているソフトウェアを利用したコンピューターで、輸液ポンプを始動させて膀胱内に生理食塩水を注入し、制御測定を開始します。30分間にわたり、代謝ケージをデジタルバランス上に吊り下げ、ラットの排尿量を推定します。

膀胱の充満および排尿に伴う膀胱内圧を記録します。次のステップでは、さらに30分間のデータ収集を行いながら、薬剤を全身的または膀胱内に投与することができます。実験終了後、動物を安楽死させます。

ラットの典型的な圧力波形では、液体注入中に膀胱内で緩やかに圧力が上昇し、ある閾値に達することが示されています。その後、膀胱が収縮し、尿道括約筋が開くことで、注入された溶液が尿道を通って排出されます。これにより、膀胱が空になります。

収縮は停止し、圧力は再び基底レベルまで低下します。マウスから収集されたデータもすべて同様の特徴を示しています。マスタードオイル（MO）の分子標的を特定するためにサイトメトリーが使用されました。MOは非常に反応性の高い化合物であり、膀胱などの内臓器官の炎症および痛覚過敏の実験モデルに長らく使用されてきました。

予想通り、10 millimolar MOの膀胱内注入により、野生型マウスでは収縮間隔の著しい短縮が誘導されました。興味深いことに、MO受容体TRPA1欠損マウスでは、同条件下で野生型と同様の結果となりました。対照的に、TRPV1ノックアウトマウスでは、野生型マウスに比べてMOによる系統的パラメータの変化が大幅に弱まり、TRPA1とTRPV1の両方を欠損させたダブルノックアウトマウスでは、MO投与に対してほとんど反応を示しませんでした。

データは、TRPV1がMOによって誘発される内臓刺激において重要な役割を果たしている可能性を示唆しています。MOの膀胱内注入前および注入中の平均瞬間排尿頻度は、これらのデータを裏付けています。平均頻度は、生理食塩水の注入に対する相対値です。

この手順を行う際は、注入液が腹腔内に漏れ出さないよう、カテーテルが膀胱にしっかりと固定されていることを確認することが重要です。このビデオを視聴することで、膀胱内圧の測定方法を十分に理解できるはずです。これには、膀胱へのカテーテルの留置、および制御された膀胱灌流下での覚醒または麻酔状態の動物のサイトメトリーステージへの配置が含まれます。