低親和性細胞外受容体 - リガンド相互作用の検出のためのスケーラブルな親和性ベースの細胞外相互作用のスクリーニング（AVEXIS）

この手順の全体的な目的は、細胞認識プロセス、特に膜埋め込み型受容体タンパク質に関与する新しい細胞外タンパク質相互作用を発見することです。AveXisアプローチは、この種のタンパク質相互作用に特有の非常に弱い相互作用親和性と、膜タンパク質の生化学的な操作が困難であるという事実に対処するように設計されています。これは、まず細胞表面受容体の細胞外領域のリコンビナントタンパク質ライブラリを構築することによって達成されます。

これは、受容体のエクトドメイン領域を、モノマーのビオチン化ベイトおよびペンタマーの酵素タグ付きプレイズの両方として、可溶性断片として産生する発現プラスミドを設計することで達成されます。第2のステップは、タンパク質を発現させ、相互作用スクリーニングに備えて標準化することです。すべてのタンパク質は、ジスルフィド結合や糖鎖付加などの翻訳後修飾が付加されることを確実にするため、哺乳類細胞で産生されます。

プロトコルの極めて重要なステップは、ライブラリ内のベイトタンパク質とプレイタンパク質がすべて閾値レベル内に正規化されていることを確認することです。次に、最も重要な段階である新規相互作用のスクリーニングを行います。ベイトをマイクロタイタープレートの各ウェルに配置し、プレイを用いて相互作用を探索します。

次に、洗浄ステップを行います。最終ステップでは、ベイトタンパク質の配列上に捕捉された獲物を検出するため、酵素の基質を添加します。最終的に、VEXスクリーニングの結果により、どの細胞表面受容体が結合パートナーを形成でき、したがって細胞間の認識および通信プロセスに関与している可能性があるかを示すことができます。

酵母ツーハイブリッド法や生化学的な精製法などの一般的なタンパク質抽出法に対する本手法の主な利点は、細胞外のタンパク質間相互作用を検出するために特化して設計されている点にあります。本手法は、特に膜結合型受容体タンパク質間の新たな相互作用の発見に適しています。膜タンパク質は生化学的な操作が困難であり、また通常、その受容体との相互作用は極めて弱いため、他の手法ではこれらの相互作用を検出することが困難です。

この手法は、細胞がどのように互いを認識し、通信しているかという重要な疑問を解明するのに役立ちます。分子レベルでは、卵子や精子の表面に提示されたどの受容体タンパク質が互いに結合したか、あるいは心筋細胞の融合や神経堤の形成といった細胞挙動にどの受容体リガンド相互作用が関与しているかなど、基礎的な生物学的プロセスに関する疑問の解決に利用できます。このアプローチにおける主な課題は、相互作用をスクリーニングするための「ベイト・アンド・プレイ（bait and pray）」タンパク質ライブラリを構築することです。

また、ベイトタンパク質とプレイタンパク質が、アッセイで要求される閾値レベル内で標準化されていることを確認することが非常に重要です。これにより、偽陰性および偽陽性の頻度を低減できます。私は博士課程において、細胞表面タンパク質CD 200の結合パートナーを同定しようとしていた際に、初めてこの手法を考案しました。

本質的に、私はこの特定の細胞表面受容体の結合パターンはどうなっているのか、という問いを立てていました。今日においても、これは技術的に回答が困難な問いであり続けています。しかし、当時はヒトゲノムの解読がほぼ完了しつつあったため、ゲノム上のすべての細胞表面受容体の完全なリストが手に入ったことで、これらの受容体タンパク質のセットの中で、技術的にどのものが相互作用し得るかという問いに改めてアプローチできることに気づきました。

これは非常に答えを出しやすい問いであり、AveXisはその問いに答えるために私たちが開発した手法です。ベイトおよびプレイの発現ベクターライブラリが構築されたら、それらをHEK 293E細胞にトランスフェクトする準備をします。まず、効率的なビオチン化を確実にするため、トランスフェクションの前日に、細胞を50 mLのFreeStyle 293培地に250,000 cells/mLの密度で播種します。プレイタンパク質ではなく、ベイトタンパク質を産生するために使用する培地には、D-ビオチンを添加してください。すべてのプレートを準備した後、細胞を標準的な条件下で一晩インキュベートします。

ビオチンは溶解度が低く、正確な溶液調製が困難であるため、追加のビオチンを秤量して培地に加え、翌日まで激しく振とうする方法を推奨します。50 mLの培養細胞に、適切なトランスフェクション試薬を用いて、25 µgのベイトまたはプレイプラスミドをトランスフェクションし、ビオチン化ベイトを生成させます。この際、ベイト構築物と分泌型ELIタンパク質ビオチンリガーゼをコードするプラスミドを10:1の比率で共トランスフェクションし、回収します。

細胞を 3000 ×g で 20 分間遠心分離してペレット化し、次に上清を 0.22 µm フィルターでろ過することで、トランスフェクションから 5 日後の培養液を回収します。AveXis の主な特徴の一つは、リコンビナントタンパク質が分泌されるため、閾値内の活性にまで希釈または濃縮できることです。リコンビナントタンパク質の発現量は最大 4 桁まで変動することが分かっているため、この標準化ステップによってスクリーニング工程における偽陽性の発生を減少させることができます。

ベイトの正規化を開始するには、非結合のデビオチンがストレプトアビジンの結合部位においてビオチン化ベイトタンパク質と競合するため、透析によって培地から除去する必要があります。まず、ベイトを透析チューブに封入します。組換えタンパク質の効果的な透析を行うには、透析チューブの表面積を十分に確保することが重要であることが分かっています。通常、透析させる液量に対して実際に必要とされる量の2〜3倍のチューブを使用します。

透析後、24時間にわたり、PBSなどの適切なバッファーを用いてベイトを十分に透析させます。次に、BSAを含むPBSTでstrepコード化マイクロプレートのウェルを15分間ブロッキングし、ELISAを開始します。その間に、きれいなプレートを用いて、2% BSA含有PBST中でベイトタンパク質の1/3連続希釈を4段階で調製します。

15分間のインキュベーション後、希釈液をstrep TTRコード化プレートに移し、室温で1時間インキュベートします。1時間後、ウェルを洗浄し、各ウェルに2 µg/mLのOX 68を100 µLずつ加えます。プレートを室温でさらに1時間インキュベートします。2回目のインキュベーション後、再度洗浄を行い、プレートに抗USアルカリホスファターゼを充填します。

プレートを室温でさらに1時間インキュベートします。次に、プレートをPBSTで3回洗浄し、最後にPBSで洗浄します。残留した界面活性剤を除去するため、1時間後にジエタノールアミンバッファーで希釈した1 mg/mLのsubstrate 1 0 4を100 µL添加します。

室温で405 nmの吸光度を測定します。4種類の異なる透析済みベイト上清の希釈系列を、抗CD4タグモノクローナル抗体を用いたELISAにより検出しました。未希釈の発現ベイトタンパク質でストレプトアビジンコーティングプレートのすべてのビオチン結合部位を飽和させるのに不十分な場合は、Viva Spin濃縮器を用いてタンパク質を濃縮してください。それ以外の場合は、2% BSA含有PBSTで希釈したベイトタンパク質を使用してください。

これは、アッセイのビオチン結合部位を飽和させるのに十分な量です。ベータラクタマーゼの酵素活性を用いて、前駆体タンパク質が発現している相対的なレベルを定量します。まず、パラプロテインを含む上清をPBST 2%BSAバッファーで希釈し、希釈系列を作成することから始めてください。

次に、希釈液 20 µL を、プレートに分注した nitrous stepin 溶液 60 µL に加えます。直ちにプレートをプレートリーダーに移し、遠心濃縮器または 2% BSA 含有 PBST による希釈を用いて、その後 20 分間、1 分ごとに 485 nm の吸光度を測定します。アッセイ中のすべての nitros を約 7 分で加水分解するようにサンプルの最終濃度を設定します。これは、1 分あたり約 2 ol nitros turnover に相当します。

strep TAVR ENC コーティングプレートを PBST で洗浄し、ペーパータオルで軽く叩いて水分を除去することで、AveXis スクリーニングを開始します。次に、各ウェルに BSA 含有 PBST を加え、プレートを 30 分間インキュベートします。これにより、非特異的なタンパク質結合部位をブロックします。

各ウェルから、プレートをシンクの上で軽く弾いてブロッキング液を除去し、適切なウェルに100 µLの規格化されたビオチン化モノマー状ベイトを添加します。プレートを室温で1時間インキュベートします。その後、再びプレートを弾いてベイトサンプルを除去し、PBSTで3回洗浄します。

3回目の洗浄後、軽く叩いて水分を取り除きます。次に、各ウェルに100 µLの正規化されたペンタマープレイコンストラクトを加え、プレートを室温で1時間インキュベートします。1時間後、PBSTでさらに3回洗浄し、最後にPBSのみで洗浄します。

最後に、各ウェルに60 µLのnitrous seven溶液を加え、プレートを室温で2時間、または好ましくは4 °Cで16時間インキュベートします。翌日、陽性相互作用は赤色に変化します。視覚的記録のためにプレートの写真を撮影し、その後プレートリーダーを用いて吸光度485 nmで反応を定量します。

AveXisスクリーニング反応の開始から約10分後、抗体介在性プリキャプチャーコントロールおよびポジティブコントロール相互作用の両方で、黄色から赤色への色変化が観察されました。この色変化は、基質中の亜硝酸の加水分解を示しています。この時間スケールで観察可能なポジティブな相互作用もありますが、ほとんどの場合は出現までに数時間を要しました。

通常、0.4%から0.6%程度のポジティブヒット率が観察されています。タンパク質ライブラリーが調製されれば、本手法のスクリーニング部分は迅速に行うことができます。相互作用が確認された後は、1日で最大12プレートまでスクリーニングすることが十分に可能です。

最も重要な次のステップは、まず、新しい独立したタンパク質調製物を用いて、この相互作用が再現可能であることを示すことです。次に、相互作用がベイト（餌）とプレイ（獲物）の方向性に依存しないこと、つまり、相互的に再現可能かどうかを常に確認します。これには、ベイトベクターのドメインをプレイベクターにクローニングし、またその逆を行う操作が含まれます。

繰り返し再現され、且つ相互的に確認された相互作用は信頼性が高いと考えられ、常にポジティブな結果が示されています。表面プラズモン共鳴（SPR）などの他の手法を用いて、再同定した相互作用をさらに検証しています。重要な点として、これにより2つの精製成分が直接相互作用できることが証明され、また結合が飽和し、したがって特異的であることも示すことができます。