TCRとそれに関連するシグナル伝達タンパク質のリアルタイムの同時イメージングのための全反射顕微鏡法

このビデオでは、2チャネル同時取得を用いてT細胞受容体のシグナリングイベントを追跡する手順について解説します。全内部反射蛍光顕微鏡（TIRF顕微鏡）を使用します。まず、T細胞にGFPタグ付きZAP 70をコードするプラスミドをトランスフェクションします。次に、脂質アンカーペプチドMHC複合体、接着分子、および共刺激分子を組み込んだガラス支持脂質二重層を調製します。

T細胞受容体がペプチドMHC複合体によって結合した状態で、ZAP 70をトランスフェクトしたT細胞を二層膜に添加します。T細胞受容体に関連するCD3鎖がSrcファミリーキナーゼであるLCKによってリン酸化され、キナーゼであるZAP 70が細胞質からリクルートされます。その後、T細胞受容体を蛍光標識し、細胞をカバーガラスよりも屈折率の低い培地に浸し、全反射が起こる角度でレーザー光を照射してイメージングを行います。

これにより、ガラスと水の界面にエバネッセント波が発生します。この波は媒質中へ指数関数的に減衰し、100から200 nanometersの浸透深さを可能にします。したがって、細胞膜上またはその極めて近傍にある蛍光分子のみが励起されます。得られた画像の解析により、シグナリングがT細胞受容体マイクロクラスター内で起こっていることが明らかになります。

TIRF顕微鏡（全内部反射蛍光顕微鏡）または従来の共焦点顕微鏡の主な利点は、解像度が向上するため、TCRマイクロクラスターなどのシグナリングクラスターやシグナリング複合体を容易に可視化できることです。私の研究室のポストドクであるTravis CritesとChenが、Maxi NucleoFector技術を用いてマウス一次T細胞にトランスフェクションを行い、その後、抗原を含むガラス支持脂質二重層で刺激し、TIRF顕微鏡を用いてイメージングする方法を実演します。

この手法は、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、マスト細胞を含むさまざまな免疫細胞のシグナリング研究に広く利用されてきました。本手法は汎用性が高く、哺乳類細胞のほとんどの受容体システム、特にクラスター内でシグナリングが発生する場合の研究に適用可能です。T細胞はトランスフェクションが非常に困難であるため、この手法に慣れていない方は、最初は苦労する可能性があります。

さらに、T細胞の生存率とトランスフェクション効率、バイラーの品質、および顕微鏡のアライメントが基準を満たすよう、精密な調整が必要です。この手順の最初のステップは、AM maxa mouse T-cell nucleo effector kitを用い、ナイーブT細胞またはin vitroで活性化させた一次T細胞に、発現プラスミドおよびGFPタグ付きのシグナル伝達分子コード配列をトランスフェクションすることです。本研究で使用したすべてのT細胞は、KのMHC分子IE上のMCCペプチドを認識するA-N-D-T-C-Rを発現していました。ここに示すトランスフェクションの手順は、製造元の推奨に従って実施しています。

しかしながら、トランスフェクション後のT細胞の生存率を高めるためのいくつかのヒントを提示します。in vitroで活性化させたT細胞は、ナイーブ細胞よりも生存率とトランスフェクション効率の両方が高いため、本プロトコルでは開始前にin vitro活性化T細胞を使用します。2 mLチューブに、キットに含まれる培地 1.9 mL、コンポーネントA 20 µL、コンポーネントB 20 µL、およびウシ胎児血清 100 µLを合わせて、トランスフェクション1回につき2 mLの添加済みT細胞培地を調製します。

12ウェルプレートの各ウェルに、培地を2 mLずつ分注します。培地を平衡化させるため、プレートを37 °Cの加湿インキュベーターに少なくとも1時間置いておきます。導入後の細胞を、低温または pH 7.2 でない培地に再懸濁させると、細胞死を招きます。導入混合液を調製するには、マウスT細胞用核導入エフェクター溶液 82 µL、サプリメント2 18 µL、および 0.5 µg/µL 以上の濃度のエンドトキシンフリープラスミドDNA 5 µgを合わせ、タッピングにより十分に混合します。

500万から1,000万個の細胞を15 mL遠心チューブに移し、室温で75 ×gで5分間遠心分離します。遠心後、吸引機を用いて上清を可能な限り除去し、細胞ペレットをトランスフェクション混合液で再懸濁させます。細胞の大きな塊がなくなるまで、細胞ペレットをゆっくりと優しく3〜4回ピペッティングします。気泡が入らないように注意しながら、ピペットを用いて懸濁液を認定済みのamaxa veteに慎重に移します。

ニュークレオエフェクターデバイス上で、選択した核エフェクタープログラム X 0 0 1 を設定します。veteをQ veteホルダーに挿入し、ボタンを押して選択したプログラムを適用します。その後、veteとあらかじめ平衡化した培養液を直ちにフード内へ移動させてください。

付属のプラスチックピペットを使用して、あらかじめ平衡化した培地を約500 µL、ウェルに加えます。次に、細胞懸濁液をプレート内の培地に、一滴ずつ滴下して加えます。

GFPタグ付きタンパク質を低レベルで発現させ、過剰発現によるアーティファクトの出現を最小限に抑えるため、細胞を37 °Cで4時間インキュベートします。このセクションでは、顕微鏡の全コンポーネントの電源を入れる前に、2チャンネル同時イメージングのために顕微鏡をアライメントする方法について説明します。コンピュータとソフトウェアを起動してください。

次に、すべてのハードウェアコンポーネントがソフトウェアに認識されていることを確認します。ソフトウェアがエラーメッセージなしに起動したため、すべてのコンポーネントが検出されました。sub resolutionを1 µL希釈します。

共局在化標準として使用するため、Flores 輝度マルチ蛍光マイクロスフィアを 2 mL の PBS に懸濁させます。次に、マイクロスフィア懸濁液を 0.25 mL ずつ、Lab Tech 8ウェルチャンバーカバーグラスシステムの各ウェルに加えます。チャンバースライドシステムを対物レンズ上のプラットフォームに設置してください。

次に、ライブプレビュー上で、ガラス上のビーズ吸着部分にピントを合わせます。左側のパネルは、GFP導入細胞が可視化されるチャネルです。右側のパネルは、生細胞イメージング実験中の標識されたTCRを表示します。

XYZファイバーランチャーのY軸アライメントを使用して、レーザービームが対物レンズから出て天井に投影されるようにビームの位置を調整します。この操作は、対物レンズがガラス面を焦点に合わせる位置にある時に行うことが重要です。天井に投影されたビームが拡散している場合は、ビームがコリメートされていません。

実験で使用する各レーザーラインについて、完全なコリメーションを確認するため、Zマイクロメーターを調整します。次に、レーザーパワーメーターを用いて、各チャンネルのレーザー出力を 20 to 30 µW に調整します。T細胞はレーザー放射に非常に敏感であるため、照射される合計出力は 50 µW 以下に制限してください。

次に、ターフの角度を設定します。ファイバーランチのY軸アライメントマイクロメーターを回し、対物レンズに対する光軸の角度が90度になるまで、ビームを天井から遠ざけます。

全反射の臨界角に達すると、レーザー光は対物レンズから出なくなります。ターフアライメント（turf alignment）が達成されているかを確認するために、カバーガラスの平面を挟んでピントを上下に動かしてください。ここで、表面に吸着しているビーズのピントが外れると、多くのビーズが溶液中に浮遊しているのが見えることに注意してください。良好なターフアライメントを実現するには、対物レンズに対するビームの角度を大きくする必要があります。

ビームの角度を大きくすると、表面付近に浮遊しているビーズが消え始め、界面に吸着したビーズの強度が上昇します。ここで、界面に吸着したビーズを焦点から外すと、溶液中に浮遊しているビーズは一切見えなくなります。この時点で、カバーガラスに吸着したビーズのみが合焦しているため、定盤の調整が正しく完了したことになります。

次に、赤色と緑色の蛍光チャンネルを互いに合わせるため、ビーズに焦点を合わせ、両方のチャンネルで生成された画像内の識別可能な特徴の位置を比較します。一方のカメラスタンドにあるXおよびYマイクロメーターネジを使用して、ビーズの相対的な位置をできるだけ近づけます。ここでは、両方の画像の左下領域にある明るいビーズに着目し、2つのチャンネル間の空間的なアライメントを確認してください。

この特徴点を両方の画像で同じ相対位置に合わせます。両方のチャンネルから画像をキャプチャして保存します。これらの画像は、2つのチャンネルを整合させるための共局在標準として使用されます。

このアライメントの例として、アライメント前の状態をここに示します。サブ解像度ビーズの2つのチャネルからの画像を重ね合わせたこの画像に示すように、一方のチャネルがもう一方に対して回転しています。調整後、画像はここに示すようにアライメントされます。

GFPを導入した生細胞の画像を比較することで、アライメントの精度をさらに詳しく確認できます。2つのチャンネルにおけるLailaポディウムが完全に一致していることに注目してください。これは、蛍光マイクロビーズを用いて確立したキャリブレーションを用いて、2つの画像をアライメントした後の状態です。

顕微鏡のセットアップが完了したら、抗原を提示するガラス支持脂質二層膜を含むフローチャンバーを調製し、まず基板と相互作用するTRANSFECTED T細胞を可視化するためにturf Mを実施します。AnaとDustinによって記載されたプロトコルに従い、Ni-NTA脂質、接着分子ICAM-1、およびペプチドMHC複合体を含むガラスカバースリップ上に平面脂質二層膜を形成し、フローチャンバーを組み立てます。MCC負荷IEFKは、ヒスチジンタグを介して脂質二層膜に組み込まれます。

共刺激分子CD 80を組み込みます。GPIアンカーを用いてフローセルを顕微鏡のステージ上に配置し、テンションバーでチャンバーを顕微鏡ステージのアダプタープレートに固定して安定させます。次に、温度を制御するため、メーカー提供の加熱素子をフローセルに取り付けます。

対物レンズをバイレイヤー上に配置し、バイレイヤー面をフォーカスさせます。対物レンズとフローセルの加熱を可能にするため、フローセルおよび対物レンズのヒーターをオンにし、チャンバーの温度を37 °Cにします。4時間のインキュベーション後、分断したT細胞を15 mLチューブに移し、80 ×gの速度で遠心分離します。細胞を300 µLのH-B-S-B-S-Aバッファーで再懸濁します。次に、TCRを標識するため、H 57 FAB（最終濃度10 µg/mL）またはH 57シングルチェーン可変断片（最終濃度20 µg/mL）を添加します。

細胞を5 mLのファルコンチューブに移します。次に、1 mLのスリップチップシリンジを用いて、3方コックを介して細胞をフローチャンバーに注入します。デュアルチャンネルのライブキャプチャでTCRチャンネルとGFPチャンネルのライブプレビューが表示されるようにイメージング条件を設定し、形質導入された細胞が存在する視野を探します。

TCRとGFPの間で強度に差があるため、両方のチャネルで細胞を可視化できるよう、画像のスケーリングをリアルタイムで調整する必要がある場合があります。ここで行っているように、ガラス面に向けてフォーカスを上げていき、側面の膜染色が検出されないことを確認して、ターフ照明を確認してください。側面の膜にフォーカスが合わなければ、ターフのアライメントは適切です。

このライブプレビューでは、カバーガラスの平面上および、顕微鏡を適切なZ軸合わせにするためにカバーガラスの焦点をずらした時の両方で、側方膜染色が確認できます。対物レンズに対するレーザーの角度を大きくすると、側方膜の焦点が外れます。個別の画像およびタイムラプスシーケンスのキャプチャを、10秒の間隔で開始してください。

細胞を、1平方マイクロメートルあたり6分子のペプチドをロードしたHisタグ付きIEFK、1平方マイクロメートルあたり100分子のAlexa 647結合Hisタグ付きICAM-1、および1平方マイクロメートルあたり100分子のGPIアンカー型CD80を含む、ガラス支持INTAバイレイヤー上で5分間インキュベートしました。Alexa 546結合H57 FABフラグメントを継続的に添加した状態で、デュアルチャンネル同時収集TIRF顕微鏡観察を行いました。

TCRを染色するため、二層膜との初回接触から1時間後まで細胞をイメージングしました。1細胞あたりのZAP 70クラスター数を、自動クラスターカウントソフトウェアを用いて解析しました。各ケースにつき、少なくとも40個の細胞を解析しました。

ロードされたペプチドは挿入図に示されています。ICAM-1は、Alexa 647結合Hisタグ付きICAM-1を1平方マイクロメートルあたり100分子含むバイレイヤー上の細胞を指します。図に示すように、zap-70依存性シグナリングはTCRマイクロクラスター内で発生し、アゴニストリガンドに反応してのみ起こることが、1フレーム10秒で撮影したこの動画から確認できます。

アゴニストペプチドに応答したTCRシグナリングは、接触領域の辺縁部でTCRマイクロクラスターが連続的に形成され、そこにZAP 70がリクルートされることで維持されます。このビデオを視聴することで、maxa核導入技術を用いて初代T細胞にトランスフェクションを行い、TURF顕微鏡を用いてTCRマイクロクラスターへのGFP標識シグナル分子のリクルートを適切にイメージングする方法について、十分な理解を得ることができます。この技術を習得すれば、適切に実施することで7時間で完了させることが可能です。

この手順を行う際は、初代細胞を非常に丁寧に扱うことが重要です。実験の各ステップで細胞の状態が健全であるほど、トランスフェクション効率が高まり、イメージングで捕捉できる細胞数も増加します。T細胞は非常に動的なため、TCRチャネルとGFPチャネルを順次イメージングすると、TCRマイクロクラスターや細胞の移動により、2つの画像が完全に一致しなくなります。

この問題を解決するために、私たちはデュアルチャンネル同時取得ターフ顕微鏡を開発しました。