マウスの中枢神経系における幹細胞注入のマルチモーダルイメージング

この手順の全体的な目的は、マウス脳に移植された幹細胞のin vivoにおける挙動について、標準化された追跡調査を行うことです。これはまず、EGFPとルシフェラーゼを共発現させた骨髄由来間質細胞を、蛍光標識されたマイクロサイズ酸化鉄粒子で標識することによって達成されます。次のステップでは、MPIOで標識したBMCをマウスの脳組織に適切に注入します。

次に、バイオリミネッセンスイメージングおよび磁気共鳴イメージングを用いて、細胞移植片の生存と局在を非侵襲的に追跡します。最終ステップは、死後の組織学的解析を用いてin vivoイメージングの結果を検証することです。これらの手法は、マウス脳への移植後における幹細胞の挙動に関する知見を提供しますが、モデル生物や疾患研究などの他の系にも適用可能です。

静脈内および脳内注射は手技が難しく、動物の生存に影響を及ぼすリスクがあるため、動物のハンドリング手順を習得することが困難です。したがって、本手法の視覚的なデモンストレーションは極めて重要です。この手順を開始するには、sub confluentな増殖中の細胞培養液に 75 × 10⁶ 個の glacial blue マイクロンサイズ酸化鉄粒子を添加します。エンドサイトーシスによる粒子の取り込みを促すため、さらに 16 時間インキュベートし、その後、残りの粒子を洗浄して取り除きます。

細胞のコンフルエンスを得て、G-B-M-P-I-Oを均一に分布させるため、さらに24時間培養します。その後、蛍光顕微鏡を用いて、EGFP陽性細胞の総数に対するEGFP陽性かつG-B-M-P-I-O陽性細胞の割合を算出することで、粒子の取り込みを視覚的に検証します。次に、G-B-M-P-I-Oで標識したBMSCルシフェラーゼEGFP細胞を、10 millilitersで2回洗浄します。

トリプシンEDTAで細胞を処理し、その後回収します。次いで細胞を洗浄し、PBS中で最終濃度が133×10⁶ cells/mLとなるように再懸濁します。最後に、移植まで細胞を氷上で保持します。

本手順では、ケタミン 80 mg/kg とキシラジン 16 mg/kg の混合液を腹腔内投与し、マウスを麻酔します。マウスが入眠するまで5分間待ち、その後、無菌的操作を行うために頭部を剃毛します。次に、マウスを脳立体定位固定装置に固定し、皮膚をアルコールで消毒します。

その後、脱水を防ぐために眼軟膏を塗布します。海馬を標的とするため、正中線に沿って頭皮を切開し、頭蓋骨を露出させます。歯科用ドリルバーを用い、後方に2 mm、外側に2 mmの位置に頭蓋骨の穿孔を行います。

ここで、細胞懸濁液を短時間ボルテックスし、シリンジで細胞懸濁液を吸引します。続いて、注射針を硬膜下 2.5 millimeters の深さまで下ろし、1分間圧力を平衡化させます。1分後、針を硬膜下 2 millimeters の位置まで引き上げます。

次に、自動マイクロインジェクションポンプを用い、0.70 µL/min の速度で 3 µL の細胞懸濁液を注入します。注入後、注入した細胞懸濁液の逆流を防ぐため、さらに 5 分間待ちます。その後、ゆっくりと針を後退させます。

その後、皮膚の縁を消毒し、皮膚を縫合します。脱水を防ぐため、0.9% sodium chloride solution 300 µLを皮下に注射します。最後に、マウスを保温ランプの下に置き、麻酔から回復させてから生物発光イメージングを行います。

3%イソフルランと酸素の混合ガスでマウスを麻酔します。その後、マウスをフォトニクスイメージャー内に配置します。イソフルランの濃度を1.5%に調整し、麻酔レベルを下げます。次に、D-ルシフェラーゼを体重1kgあたり150mgの用量で静脈内注射します。

Photo Visionソフトウェアを使用して、5分間画像を撮影します。その後、M3 Visionソフトウェアを用いて画像処理を行い、固定した関心領域（ROI）を用いて観察された信号を定量化します。磁気共鳴画像法（MRI）を行う際は、酸素と一酸化窒素の混合ガス中において、3%イソフルランでマウスを麻酔してください。

次に、マウスを水平型9.4 Tesla MRシステムの拘束具に入れます。イソフルランを1%に調整し、麻酔レベルを下げます。続いて、脱水を防ぐためにマウスの目に軟膏を塗布します。その後、直腸プローブを用いて体温をモニタリングします。

次に、呼吸数をモニタリングするためにマウスの腹部にセンサーを配置します。呼吸数を110 ± 10回/分に維持し、体温を37 ± 0.5 °Cの狭い範囲で一定に保ちます。その後、マウスの頭頂部に表面RFコイルを配置します。

マウスをマグネットの中央に配置します。次にParaVision 5.1を開きます。付属の原稿に従ってシーケンスパラメータを設定してください。その後、特定の解剖学的情報を得るために、10枚の冠状面T2強調スピンエコー画像を取得します。

70 µm²の平面解像度で幹細胞の遊走を研究するため、NT 2-star加重グラディエントエコー像を取得します。このステップで、マウスを犠牲にして脳を取り出します。脳組織を室温で、PBSで調製した4%パラホルムアルデヒドを用いて2時間固定します。

2時間後、脳組織を4°Cで異なる濃度のショ糖溶液に浸し、脱水させます。翌日、液体窒素を用いて脳組織を凍結し、切片作成まで-80°Cで保存します。

クライオスタットを用いて、脳組織を10 micrometer厚の切片に作成します。その後、蛍光顕微鏡下で、未染色の凍結切片におけるG-B-M-P-I-O粒子由来の青色蛍光およびEGFP発現細胞由来の緑色蛍光を確認します。続いて、未染色の凍結切片において、炎症細胞による緑色および赤色の背景蛍光を確認します。

記述されたglacial blue MPIOによる標識手順により、BMSC、ルシフェラーゼEGFP細胞を極めて効率的に標識することができ、これは蛍光顕微鏡を用いて容易に検証可能です。次に、G-B-M-P-I-Oで標識したBMSC、ルシフェラーゼEGFP細胞をマウスの中枢神経系（CNS）に移植すると、ルシフェラーゼ活性に基づくin vivo生物発光イメージングによって、移植細胞の生存をモニタリングできます。さらに、glacial blue MPIOの鉄含有量に基づくin vivo磁気共鳴イメージングにより、移植細胞の正確な局在をモニタリングすることが可能です。

最後に、組織学的解析により、生物発光イメージングおよび磁気共鳴イメージングで得られた結果の妥当性が示されました。移植後の経過時間において、EGFPの発現が安定して維持されていることで、安定した生存が確認されました。本手法は、分子イメージング分野の研究者が、神経変性疾患のさまざまな動物モデルにおける幹細胞移植後の細胞および分子レベルのイベントを探索するための道を切り開きました。

このビデオを視聴することで、バイオルミネッセンスおよび磁気共鳴画像法を用いた分子イメージングの実施方法と、死後組織学的評価によるin vivo結果の適切な検証方法について深く理解することができます。