逆行性蛍光標識は、特定された神経細胞から標的細胞外シングルユニット記録を可能にします

この手順の全体的な目的は、非遺伝学的なモデルシステムにおいて、特定されたニューロン集団から生体内でシングルユニット応答を記録することです。まず、開頭術を行い、目的の脳領域を露出させます。次に、タングステン電極を用いて、標的ニューロンが投射する領域に蛍光色素を導入します。

次に、色素が逆行性に輸送され、これにより投射ニューロンが選択的に標識されます。最終ステップは、個々の投射ニューロンの標識された軸索から記録を行うことです。最終的に、単一ユニット細胞外記録を用いて、無傷の回路内の中心感覚ニューロンがevoにおける感覚刺激にどのように反応するかを示します。

この手法は、神経回路がシナプス入力のタイミングにおけるサブミリ秒単位の差をどのように検出するかという重要な問いに答えるのに役立ちます。既存の手法に対するこの技術の主な利点は、個々のニューロンや軸索、さらには遺伝学的に操作不可能な系を標的にできることです。弱電気魚は、通信やナビゲーションに電気信号を利用しています。

彼らは、シナプス入力のタイミングにおける1ミリ秒未満の差を利用して、異なる魚からの信号を区別します。私たちは、彼らの電気感覚回路にある時間比較ニューロンと推定される細胞が、どのようにしてこのような微小なタイミングの差を検出できるのかを研究しました。また、この手法は、視覚や聴覚の感覚経路などの他のシステムにも適用可能です。

周囲の組織に密集して埋もれていることや、細胞体の大半を覆うシナプス前終末により、これらの細胞から液体を回収することは特に困難です。ホールセル記録中の細胞内染料注入により、in vitro で単一の細胞を標識し、その軸索からの標的記録を導くことができます。同様に、細胞外染料注入後の逆行性輸送は、脳の表在領域にある投射ニューロンを選択的に標識する手段となります。

これは、in vivoでのシングルユニット記録に視覚的なガイダンスを提供するために使用できます。Dコード化針を準備するには、まず、直径160 µmのタングステン線を、最終的な針先の直径が5〜50 µmになるまで電解研磨します。次に、実験の前夜に、全身麻酔を導入する前に、10,000分子量デキストラン結合Alexa Fluor色素の2 mM溶液で針先をコード化します。

魚を300 mg/LのMS 222溶液を含む水槽水に入れ、背部の筋肉に3 mg/mLのflailを100 µL注入して、魚を固定し電気的に静止させます。次に、記録チャンバーに水槽水を満たし、魚を腹側を下にしてチャンバー中央のプラットフォーム上に置きます。その後、ピペットチップを口に挿入し、エアレーション済みの100 mg/L MS 222溶液を1〜2 mL/minで投与します。

その後、固定棒とワックスを用いて、魚の体の両側を固定して安定させます。眼球血管の持続的な血流と正常な体色を確認し、魚の健康状態をモニタリングします。次に、プラットフォームを垂直軸に沿って回転させます。

プラットフォームの一端を調整し、魚の頭部の背面の片側が水面上に露出するようにし、体のそれ以外は水に浸かったままにします。皮膚の露出している部分が乾燥するのを防ぐため、小さなキムワイプを当てます。この手順では、Qチップを用いて、頭部の露出面に0.4% lidocaineを塗布します。

次に、メスを用いて、6.2 cmの魚から約3 mm × 5 mmの長方形の皮膚組織を切り出します。長方形の外側端は眼の中心に合わせます。長方形の前側端は眼の直後、内側端は正中線の直外側に位置するようにします。

続いて、ピンセットを用いて矩形部分を取り除きます。さらに前方正中線に沿って2.5 mm四方に切開し、頭蓋骨を露出させます。メスを用いて余分な組織を掻き出し、露出した頭蓋骨表面を完全に清掃します。

次に、キムワイプとエアダスターを用いて表面を完全に乾燥させます。続いて、瞬間接着剤を用いて、露出した頭蓋骨の前内側領域に金属製ポストを接着します。接着剤が完全に乾くまで待ちます。

直径0.5 mmのボールミル超硬チップ付き歯科用ドリルを使用して、体長6.2 cmの魚の頭蓋骨上に、約2 mm × 4 mmの長方形を描きます。その後、メスとピンセットで長方形の周囲を切開します。そして、頭蓋骨を剥がします。

脳を露出させるため、スプリングシザーまたは針を用いて、色素沈着した硬膜と透明な軟膜の両方を切開します。次に、切開した部分をピンセットで取り除き、前外側核と後外側核を露出させます。ここで、あらかじめ準備したDコーティング針を取り付けたマニピュレーターを、目的の軸索を含む標的領域の上に配置します。

本ケースにおける後外側核では、針を組織内へ約25 µmまで迅速に刺入します。色素が15〜30秒間拡散した後、針を抜去します。必要に応じて、新しい針を用いてこの操作を繰り返してください。

染料が標的領域全体に分布するように、それぞれを異なる位置に配置します。その後、ヒックマン・リンガー液を用いて腔内の過剰な染料を洗い流し、染料の取り込みと輸送のために少なくとも2時間待ちます。目的の軸索を可視化するために、魚が入った記録チャンバーを正立固定ステージ共焦点蛍光顕微鏡の対物レンズ下に配置します。

呼吸用溶液を新鮮なタンク水に切り替え、同じ流速を維持します。次に、接地線の片端を露出した脳腔に配置し、もう一方の端を記録ヘッドステージの接地端に接続します。続いて、一対の記録電極を尾の基部の隣に配置します。

次に、電極を差動増幅器と記録装置に接続します。電気器官放電指令（EODC）をモニターするために、低倍率で観察した脳領域の縮尺スケッチを作成し、ラベル化された軸索の正確な位置を特定するための目印として主要な血管を書き込んでおきます。まずDの配置を確認するため、明視野照明で組織全体を観察し、方向を合わせます。

次に、蛍光照明下で観察します。後外側核にびまん性の標識が認められるはずです。その後、高倍率で、血管を指標にして前外側核を特定します。

外径1mm、内径0.58mmのホウケイ酸キャピラリーガラスとフィラメントを用い、表面付近にある標識された軸索を探索しながら、蛍光光で照明します。シャック部分の長さが5mmで、先端径が約1〜2.4µmの記録用電極を引き出します。

電極にろ過したヒックマンリンガー液を満たします。最終的なチップ抵抗値が16〜155 MΩの範囲にあることを確認してください。電極を圧力ポート付きの電極ホルダーに装着します。

これをマニピュレーターに取り付けられたヘッドステージに接続します。次に、ヘッドステージをアンプに接続します。図示されていないアナログ-デジタル変換装置が、アンプとコンピュータを接続しています。

その後、電極ラインに30 millibarの正圧をかけます。組織表面から、電極を軸索に向かってゆっくりと進めます。電極が軸索に近づくと、電極が軸索の隣にあるときに、正圧によって軸索にわずかですが明確な動きが生じます。

テスト刺激提示中の活動を記録します。電気的なアーティファクトによって適切な記録と刺激が確認できても、活動電位は認められないはずです。電極の外向きの圧力を解除し、刺激と記録を繰り返します。

次に、軽く吸引して軸索を電極内に移動させます。刺激と記録を再度繰り返します。これで、刺激に反応していくつかの活動電位が観察されるはずです。

活動電位が確認できたら、加圧ラインを閉じます。目的の記録がすべて完了したら、魚が完全に麻酔状態にあることを確実にするため、タンクの水を 100 mg/L の MS 222 を含む呼吸液に戻します。魚を安楽死させる前に、少なくとも 10 分間は EODC が検出されないことを確認してください。

ここでは、0.1ミリ秒、6mV/cmの単相対側陽性横方向方形パルス刺激によって誘発された5つのサンプル波形を示しています。また、ここでは、同じユニットに対して0秒時に6mV/cmの刺激を与え、75ミリ秒の記録ウィンドウを20回繰り返した際のスパイクタイミングを示すラスタープロットを示しています。持続時間の範囲は右側に記載されています。ここに示されているのは、刺激持続時間のチューニング曲線であり、刺激1回あたりのスパイク数として反応を定量化したものです。

この手法で示された手術と色素注入は、適切に行えば習得後に1時間で完了させることができ、色素注入の2〜3時間後に記録を開始することが可能です。この処置を行う際は、処置後の実験動物の健康状態を注意深く観察することが重要です。さらに深い脳構造にあるニューロンから記録を行うには、2光子イメージングなどの他の手法を用いることができます。

このビデオを視聴することで、特定されたニューロン集団から単一ユニット応答をラベル付けし、記録する方法について十分に理解できるはずです。