同所性肺移植のマウスモデルにおける閉塞性細気管支炎の開発

本手順の全体的な目的は、鏡像正位肺移植を模した反復性細気管支炎モデルを構築することです。まず、C 57 BL 10マウスからドナー肺を採取します。次に、吻合のために気管支、肺動脈、および肺静脈のカフを準備します。

次に、調製したドナー肺をレシピエントのC57BL/6マウスに移植します。最終ステップとして、移植後21日間または28日間、移植マウスを観察します。最終的に、組織学的解析を用いて、移植肺における細気管支炎病変を示します。

ミラーリング異所性気道移植モデルと比較した本モデルの主な利点は、現在のモデルがヒトの状態を模倣している点にあります。一般的に、この手法に不慣れな方は、マウスの上部構造が非常に繊細であり、ラットの10分の1程度の質量しかないため、損傷しやすく苦労することがあります。ドナーマウスを密閉された保持チャンバーに入れ、5% isof fluorineで麻酔を導入します。次に、20ゲージの静脈留置カテーテルを使用してマウスを気管挿管し、げっ歯類用人工呼吸器に接続します。

1〜2%のイソフルランを用いて麻酔を維持します。尾部のフリック反応および足指のピンチ反応がなく、マウスが完全に麻酔状態にあることを確認した後、仰臥位に固定し、腹部を70%エタノールで消毒します。次に、はさみで腹部を覆う皮膚を切開し、腹壁筋を露出させます。

次に、まず腹壁に正中切開を加え、続いて胸骨を横方向に切断することで腹胸切開を行います。腸管を避け、肝臓の直下にある下大静脈（IVC）を確認します。IVCにヘパリンを100 µL/kgの用量で注入します。次に、肝臓の鎌状靭帯を下方に引き下げ、横隔膜の腹側尾側付着部に沿って脊椎に向かって切開します。

胸郭の両側を頸部まで切開し、胸腔を露出させます。肺を保護しながら肋骨を両側から切断し、胸腺を除去します。次に、横隔膜の高さで胸腔内下大静脈（IVC）を切断します。

次に心臓を確認し、右心耳を切り出します。その後、肺動脈幹の根元に横切開を加え、その切開口から2 mLの冷却ラクトリンゲル液と0.1 mLのヘパリンを用いて肺を洗浄します。気管を露出し、食道とともに切除します。

次に、呼気終末インフレーションの3分の2の段階で換気を停止させます。心肺ブロックを摘出し、氷上で保存します。摘出した肺にガーゼを被せ、遮光します。

肺靭帯を肺静脈（pv）まで切開します。食道と大動脈を除去し、肺門を特定します。肺門の最も頭側に位置する肺動脈（pa）と、それに付随する主気管支を確認します。

肺動脈を気管支から慎重に剥離します。次に、24ゲージのIVカテーテルを長さ0.5 mm、延長部分0.7 mmに切断し、PAカフを作成します。カフの表面はAB編みとなっています。

吻合のための表面を確保するため、PAカフと同様の材料を用いて、長さ1mm、延長分0.7mmにカットした20ゲージのカテーテルのみを使用して、気管支用のカフを作製します。PVカフのサイズはドナーマウスの体重によって異なります。体重24〜27gのマウスの場合。

カフのサイズは22ゲージ、長さ0.7 mm、伸長部0.7 mmのもので、体重27〜32 gのマウスに使用します。長さは同一ですが、カテーテルは20ゲージのものを使用します。次に、肺動脈、肺静脈、および気管支の遠位端にカフを挿入し、それぞれを9-0シルク縫合糸で固定します。

すべてのカフが適切に装着された後、準備したドナー肺を乳酸リンゲル液に浸したガーゼで包み、移植まで氷上に置いて保持します。レシピエントマウスを準備するために、ドナーと同様の方法で麻酔を導入し、人工呼吸管理下に置きます。

左胸壁を剃毛し、70% alcoholで清浄にします。まず、左第3肋間にて開胸切開を行います。切開線を脊椎付近まで背側に延長します。

手術野を無菌的にドレーピングし、心臓に隣接する左肺血管および気管支にマイクロ血管クランプを装着します。肺動脈は頭側に、肺静脈は肺門の尾側に、そして気管支はその間に位置していることが確認できます。次に、止血鉗子を用いて、PA、PV、および気管支に緩やかな牽引をかけます。

肺門構造をクランプしたまま、左肺を慎重に切除します。肺動脈、肺静脈、および気管支を単離し、それぞれの構造の周囲に緩く縫合糸をかけます。PAを外膜鞘から完全に剥離し、その後、血管周囲の約4分の1の範囲で前壁に小さな横切開を加えます。

動脈の背側部の連続性を維持したまま、冷ラクトリンゲル液に浸した脱脂綿ガーゼで包んだドナー肺を取り出し、胸腔内に配置します。次に、レシピエントのPA、PV、および気管支にカフを挿入して吻合部を作成し、ナノ縫合糸で結紮します。その後、レシピエント肺を除去します。

次に、肺門のクロスクランプを取り外し、再灌流と換気を可能にします。移植した肺をレシピエントの胸腔内に戻し、開胸切開部を5-0縫合糸で閉鎖します。これでマウスは麻酔から回復するはずです。マウスが意識を取り戻した後、疼痛緩和のためにブプレノルフィンを投与します。

この表は、急性拒絶反応の組織学的スコア、および閉塞性細気管支炎（OB）の有病率を示しています。移植後の急性拒絶反応のスコアリングはAスコアと呼ばれます。同種移植（allograft）群では、ISO移植（ISO graft）群と比較して、急性または慢性の拒絶反応病理がかなり多く見られます。さらに、移植後21日目および28日目において、閉塞性細気管支炎の有病率はISO移植群よりも同種移植群で有意に高くなっていました。

肺移植後28日目における肉眼的な所見および組織病理学的所見をここに示します。これらの画像は、肉眼的な所見、およびH&E染色されたISO移植肺と右側のナイーブ肺を表しています。また、これらの画像は、BL6マウスレシピエントに移植され、それぞれOBおよび非OBを発症したBL10肺同種移植片のH&E染色およびMasson's trichrome染色像を表しています。

パネルBの白い矢印は、OB病変を示しています。このパネルは、BL 10マウスレシピエントにBL 6肺同種移植を行った様子を示しています。習熟すれば、適切に実施することでこの手法はほぼ30分で完了できます。

この手法の有用性は、肺移植後の原発性グラフト機能不全、急性拒絶反応、および切除性細気管支炎に関するメカニズム的な疑問を解決するために活用できる点にあります。