血液疾患における血管相互作用を研究するためのEndothelializedマイクロフルイディクス

この手順の全般的な目的は、血管内皮細胞でコーティングされたマイクロ流体デバイスを作製することです。これは、まずマイクロ流体モールドを作製し、次にPDMSチャネルを作製することで達成されます。

次に、内皮細胞をデバイス内に播種します。最後のステップは、デバイス内で細胞を培養することです。最終的に、内皮細胞でコーティングされたマイクロ流体デバイスを用いて、in vitroでの細胞間相互作用を示します。

既存の手法に対する本手法の主な利点は、研究者が生物学的および生物物理学的条件を厳密に制御でき、かつ蛍光顕微鏡法と互換性がある点にあります。本手法は血液疾患における細胞間生物物理学的相互作用に関する知見を提供できるだけでなく、白血球生物学、がん転移、造血幹細胞生物学などの現象にも適用可能です。一般的に、細胞を正常に定着させるためには条件を厳密に制御する必要があるため、本手法を初めて行う方は習得に苦労することがあります。

作製の準備として、マイクロ流体デバイスのコンピュータ支援設計（CAD）画像を外部のマスク業者に提出し、フォトマスクを作成します。納品されたマスクは、ソーダ石灰ガラス上のクロム層で構成されています。ここでのマイクロ流路幅は30 micronsです。

マイクロ流体デバイスの作製を開始するために、まずシリコンウェハーをピラニア溶液で15分間洗浄し、その後、脱イオン水で10秒間すすぎます。次に、シリコンウェハーをフッ化水素酸に30秒間浸し、約10秒間脱イオン水ですすぎます。続いて、スピンコーターを用い、回転数3000 rpmでMicroChem SU-8 2025フォトレジストをウェハー上にスピンコートし、厚さ30 µmに仕上げます。

SU 8 20 25をコーティングしたウェハを95 °Cに設定したホットプレートの上に5分間置き、過剰な溶媒を飛ばします。この工程にオーブンを使用することは推奨されません。次に、ウェハの上にフォトマスクを配置し、マスクアライナーでUV光を照射して、SU 8 20 25フォトレジストを架橋させます。

架橋後、ウェハーを再び95°Cのホットプレート上に置き、さらに5分間加熱します。これにより、SU-8 2025フォトレジストの重合をさらに促進させます。その後、主にPGMEAで構成されるSU-8現像液にウェハーを4分間浸漬します。

これにより、架橋されていないSU 8 20 25フォトレジストが除去されます。現像したばかりのウェハを100%イソプロピルアルコールで10秒間すすぎ、その後、加圧窒素を用いて乾燥させるか、クリーンなドラフトチャンバー内で数分間溶媒を蒸発させて乾燥させます。次に、乾燥したウェハをペトリ皿の中央にテープで固定します。この際、テープをウェハの端に貼るように注意してください。

最後に、500 µLのsigma coatをウェハーにピペッティングします。ペトリ皿に蓋をし、皿を回してウェハー全体に均一にコーティングします。蓋を取り外し、溶媒が完全に蒸発するまで数分間ウェハーを乾燥させます。

PDMSポリマーと硬化剤を重量比10:1で混合した後、使用可能な真空システムの強度に応じて、真空デシケーターを用いて数分から1時間かけて気泡を除去します。すべての気泡が除去されたら、ウェハーとディッシュの表面が覆われるように、混合液をディッシュに注ぎます。これにより、厚さ約5 mmのPDMSシートを作成します。

また、厚さ1 mmの構造のない薄いPDMS片を作成します。その後、混合物を60 °Cのオーブンで一晩硬化させます。翌日、ナイフまたはメスを使用してウェハーの周囲を切り出し、複数のPDMSマイクロ流体デバイスを取り出します。

次に、シートをカットして個々のデバイスを切り離します。PDMSシートは、マイクロ流体デバイスよりもわずかに大きくカットしてください。次に、ピンバイス（Harris unicornまたは同様の器具）を使用して、マイクロ流体デバイスに入口と出口の穴を開けます。

次に、マイクロフルイディクスデバイスとシートの表面をスコッチテープで洗浄します。その後、プラズマクリーナーを使用して、マイクロフルイディクスデバイスとPDMSシートの表面に30秒間酸素プラズマを照射します。酸素プラズマによってPDMSの露出面に反応性種が生成され、物理的に接触させることで結合が生じます。

次に、20ゲージの鈍端針を装着した1 mLシリンジに、PBSで調製した50 µg/mLのヒト血漿由来フィブロネクチンを満たし、針にチューブを装着します。さらに、1本目のチューブにそれより細いチューブを挿入し、2本のチューブの間を摩擦で固定（フリクションフィット）させます。

次に、より細いチューブのもう一方の端をマイクロ流体デバイスの入口に取り付けます。シリンジに圧力をかけ、チャネル内をフィブロネクチン溶液で完全に満たし、チャネルが乾燥しないよう出口ポートに100 µLの小さな液滴を作ります。その後、マイクロ流体デバイスを37 °Cに設定した加湿インキュベーター内で40～60分間インキュベートします。

インキュベーション後、PBSを満たした新しいシリンジを鈍針に接続します。圧力をかけてマイクロ流体デバイス内をPBSで洗浄します。8%デキストランを含む内皮細胞増殖培地を用いて、1 mLあたり50万から200万個のヒト臍帯静脈内皮細胞（hve）を調製します。

デキストランを添加することで、マイクロ流体デバイス内での細胞の接着および培養が成功する可能性が高まります。鈍端針と幅広のチューブを装着した洗浄済みシリンジに細胞懸濁液を満たし、約1メートルの長いチューブを接続します。接続部からの漏れを防ぐため、チューブをしっかりと固定することが極めて重要です。

システム性能を最適化するため、シリンジおよびすべてのチューブ内に気泡がないことを確認しながら、細胞溶液でチューブ内をプライミングします。この時点で、システムへの漏れや気泡の混入を防ぐことが極めて重要です。溶液の漏れや培地中の気泡の存在は、血管内皮細胞の定着を妨げる原因となります。

すべての気泡が除去され、チューブ全体に細胞懸濁液が満たされたら、シリンジをポンプにセットし、もう一方の端をマイクロ流体デバイスの入口に接続します。シリンジポンプはマイクロ流体デバイスと同じ高さに設置します。長いチューブはインキュベーター内で注意深く巻いて配置し、細胞と培地がデバイスに到達する前に十分に加温されるようにします。

次に、細胞懸濁液を当システムを用いて、体積流量 1.23 µL/min、温度 37 °C、5% CO2 の条件下で 2 時間、マイクロ流体デバイスに注入します。1.23 µL/min の体積流量は、最小チャネルにおける流速 1 mm/s に相当します。これは、全血を用いた場合の同チャネル内における壁剪断応力 約 1 dyne/cm² に近似します。

細胞懸濁液の注入が完了したら、同じシリンジポンプと長いチューブを使用し、より大きなシリンジで新鮮な増殖培地を1.23 microliters per minuteの速度で2〜8日間注入します。細胞単層が目的のコンフルエンス度に達したら、実験のために血液または細胞懸濁液をシステムに注入します。ここでは、内皮化前のマイクロ流体デバイスを示しています。

血管系の生理学的特性を模したデバイスのサイズ、スケール、および全体的な設計を説明するため、マイクロ流体デバイスに食用色素を注入しています。明視野顕微鏡により、マイクロ流体デバイスの内皮化が確認できます。この画像は、上述のプロトコルを用いて播種してから48時間以内に取得したものであり、最適化された灌流技術によって、内皮細胞がマイクロ流体システムの内表面全体にコンフルエントに培養されています。

細胞播種から24〜48時間以内。この共焦点画像に示されているように、マイクロチャネルを備えたチップ上の微小血管腫瘍は、鎌状赤血球症による微小血管閉塞イベントの多くが発生する部位である毛細血管後静脈のサイズ（30 micron）を近似しています。本実験では、脱酸素条件下で、健康な患者からの全血をチップ上の微小血管デバイスに注入します。

この動画では、当社の内皮マイクロ流体システムにおける全血の流れが規則的かつスムーズで連続的であり、マイクロチャネルの閉塞部位がないことを示しています。ここでは、鎌状赤血球症患者の全血をチップ上の微小血管デバイスに注入しています。脱酸素条件下では、血流に著しい変化が見られ、複数のチャネルで完全な閉塞が発生しています。

本手順を実施する際は、チューブを交換する際に気泡を混入させないことが重要です。完成したデバイスは蛍光顕微鏡に対応しており、従来の蛍光アッセイに適応させることが可能です。この手法により、実験血液学者は、制御された生物物理学的および血行動態的環境下で単一細胞を用いた実験を行うことが可能になります。

気泡が入らないようにします。