マウスのビデオ眼球運動記録法

この手順の全体的な目的は、マウスにおいてビデオ眼底検査を行うことです。まず、マウスの頭蓋骨にペデスタルを設置し、専用の頭部固定装置で頭部を固定できるようにします。次に、マウスをビデオ眼底検査装置に配置し、ビデオ瞳孔追跡システムのキャリブレーションを行います。

次に、前庭および視覚運動刺激の幅広いレパートリーを用いて眼球運動系を活性化させながら、眼球運動を記録します。最終ステップとして、これらの眼球運動を解析します。最終的に、正常マウス、薬理学的処理を施したマウス、または遺伝子改変マウスを用いたビデオ眼球運動記録は、運動行動の生理学的な探索に利用できます。

この手法は眼球運動系の洞察を得るだけでなく、ヒトの病態を模倣したマウス変異体を用いることで、小脳、前庭、または眼球に起因する疾患の研究にも適用可能です。この手順を開始するには、イソフルラン、フルーレン、および酸素の混合ガスを用いて、ガスチャンバー内でマウスを麻酔させます。その後、マスクを介してガスを投与し、麻酔状態を維持します。

次に、ヒートパッドと肛門温度センサーを使用して、マウスの体温を37 °Cに維持します。続いて、眼球の乾燥を防ぐために眼軟膏を塗布し、頭頂部の被毛を剃毛して手術部位を洗浄します。その後、正中切開を行って頭蓋骨の頭頂面を露出し、表面を洗浄して乾燥させます。

次に、bgmaのリン酸を1滴Lambdaに塗布します。15秒後、エッチング剤を除去し、頭蓋骨表面を生理食塩水で洗浄して再度乾燥させます。エッチングした頭蓋骨表面の上部にopti bond primeを1滴塗布し、エアドライします。

30秒間乾燥させます。次に、OptiBondプライマーの上にOptiBond接着剤を1滴加えます。UVライトで1分間光照射します。

その後、接着層を薄いCharismaコンポジットで覆います。マグネットネジ穴付きのコネクタおよびアタッチメント部位をコンポジットに埋め込みます。次に、UV光でコンポジットを光硬化させます。

必要に応じて、さらにコンポジットを重ねて塗布し、光照射で硬化させます。手術後、マウスを少なくとも3日間回復させます。次のステップは、マウスを拘束装置にセットし、マグネットとネジ1本で頭部を固定し、マウス頭部および身体拘束装置をXYプラットフォームに取り付けることです。

XYプラットフォームを使用して、マウスの頭部をターンテーブルの中心上に配置し、マウスをピッチYa軸およびロール軸に沿って移動できるようにします。次に、アイスキャンシステムによって生成された眼の視覚画像を用いて眼の位置を合わせ、頭部を適切なピッチyaおよびロール角に配置します。これで、ターンテーブルがACサーボ制御モーターに接続されました。

ターンテーブルの位置は、ターンテーブル軸に取り付けられたポテンショメータで監視されます。ターンテーブルは、ランダムドットパターンが施された円筒形の周囲スクリーンで覆われており、このスクリーンにもACサーボ制御モーターが装備されています。円筒形スクリーンの位置は、その軸に取り付けられたポテンショメータによって監視されます。

スクリーンはハロゲンライトで照らすことができます。ターンテーブルとその周囲のスクリーンの動作は、入出力インターフェースに接続されたコンピュータによって制御されます。ターンテーブルと周囲のスクリーンの位置信号は、入出力インターフェースでデジタル化され、20 hertzの遮断周波数でフィルタリングされた後、このコンピュータに保存されます。

マウスの眼を3つの赤外線エミッターで照射します。2つのエミッターはターンテーブルに固定し、3つ目のエミッターをカメラに取り付けます。この3つ目のエミッターは基準となる角膜反射を生成し、キャリブレーション手順および眼球運動の記録に使用されます。

ズームレンズを備えた赤外線CCDカメラをターンテーブルに取り付け、ターンテーブル中央に位置するマウスの頭部に焦点を合わせます。このカメラはロックを解除することで、ターンテーブルの軸に沿って正確に20度まで移動させることができます。

キャリブレーション手順の間、ビデオ信号はアイトラッキングシステムによって処理され、瞳孔と参照角膜反射を水平方向および垂直方向に120 hertzのサンプリングレートで追跡します。次に、参照角膜反射位置、瞳孔位置、および瞳孔サイズの信号が入出力インターフェースによってデジタル化され、眼球運動をキャリブレーションするためのテーブルおよび周囲のスクリーン位置信号と同じファイルに保存されます。マウスの頭の位置をカメラに合わせて調整し、瞳孔のビデオ画像がモニターの中央に位置し、参照角膜反射の表示が瞳孔の直上の眼球垂直中心線上に配置されるようにします。

次に、カメラを垂直軸を中心として20度ずつ、数回ピーク方向に移動させます。カメラの極端な位置で記録された、追跡中の瞳孔および角膜リファレンスの位置を用いて、瞳孔の回転半径を算出します。

瞳孔径と瞳孔回転の関係を決定するために、さまざまな照明条件下でこれらの手順を何度も繰り返します。次に、瞳孔回転補正曲線を策定します。そして、角膜の基準位置、瞳孔位置、および瞳孔径を測定することにより、眼の角度位置を算出します。

瞳孔の回転値は、瞳孔の回転補正曲線から抽出することができ、目の角度位置は以下の数式を用いて算出できます。ここでは、VVOR眼球運動実験について解説します。次に、目の位置、テーブルの位置、および周囲のスクリーンの位置を角度位置に変換します。

次に、アイテーブルと周囲のスクリーンの角位置を微分し、バターワース低域通過フィルタでフィルタリングします。遮断周波数を20 Hzとして、40 deg/sの検出しきい値を用いてアイ速度信号から不随意眼球運動を除去します。その後、試行内の各サイクルごとにテーブルと目の速度信号を平均化し、平均化された信号を適切な関数でフィッティングします。

一般的に、正弦波状の速度刺激が用いられ、平均サイクルはサイン関数またはコサイン関数でフィッティングされます。この動画では、周囲のスクリーンの回転によって眼球運動がどのように誘発され、視覚的な追随反応（オプトキネティック反射）が起こるかを示しています。周囲のスクリーンを0.2から1 Hzの周波数範囲で、振幅1.6度で回転させています。マウスの視覚追随システムは、高周波数帯域よりも低周波数帯域においてより効率的であることが示されています。

ここでは、眼球運動がどのように生成されるかを示す別の動画を提示します。暗所でマウスを回転させ、0.2から1 Hzの周波数範囲、振幅1.6°でターンテーブルを回転させることで前庭眼反射を誘発させました。マウスの前庭眼系は、低周波数帯よりも高周波数帯においてより効率的であることが示されています。

ここでは、マウスを光の中で回転させ、視覚的に増強された前庭眼反射を誘発させることで、どのように眼球運動が生成されるかを示す別の動画を紹介します。周囲のスクリーンが十分に照らされている状態で、ターンテーブルを0.2から1 Hzの周波数範囲、振幅1.6度で回転させると、マウスが全周波数範囲にわたって効率的な代償性眼球運動を生成することが示されます。また、この動画では、前庭眼反射を適応的に増大させることで、どのように運動学習が達成されたかを示しています。逆位相トレーニングパラダイムを用い、周囲のスクリーンと逆位相でターンテーブルを回転させることで、このマウスのVORゲインが増大します。

このビデオを視聴することで、マウスにおけるビデオ眼底検査の実施方法について十分に理解できるはずです。