水中での超分子ポリマーのサイズ、形状と安定性を制御する

本実験の全体的な目的は、水中における超分子ダイナミックナノ粒子のサイズ、形状、および安定性を制御することです。これは、分子構造に引力的および反発的相互作用の両方をコーティングした、自己組織化または重合するダイクロイック増幅剤を設計することで達成されます。これにより、不完全な成長メカニズム（frustrated growth mechanism）がもたらされ、水中で制御された球状の自己組織化ナノ粒子が得られます。

第2ステップとして、水溶液の塩濃度を上昇させます。これにより、disco amphiの分子構造に組み込まれた反発相互作用が弱まります。これにより球状から棒状への転移が誘導されます。この球状から棒状への転移の根底にあるメカニズムを明らかにするため、温度依存性の円二色性（CD）分光分析が行われます。さらに、クライオ透過電子顕微鏡および核磁気共鳴などの分析手法を組み合わせて、ある種の凝集体から別の種への転移を測定および可視化します。その結果、球状から棒状への転移が、超分子重合における協同性の向上として発現することが示されました。

これは、サイズの制限されたナノ粒子における反協同的なプロセスから、非常に大きな超分子ポリマー（本ケースでは動的なナノロッド）へと導く完全協同的な核生成・伸長メカニズムへの転移に起因します。CD分光法、小角X線散乱、およびdo MRなどの分光学的手法と、cryoのような顕微鏡的手法を組み合わせることの主な利点は、水中の超分子ポリマーの転移を測定し、可視化できることです。これらの動的なポリマーは、温度変化、OnX強度の変化、またはpH変化などの外部刺激に反応することができます。

これらの手法を組み合わせることで幅広い適用が可能となり、分子化学や自己組織化ナノ材料の分野における重要な疑問の解決に寄与します。例えば、低分子ビルディングブロックの自己組織化によって形成される凝集体の寸法と、その根底にある形成メカニズムとの相関を調べることができます。この手法の意義は、広範なバイオナノテクノロジーへの応用にまで及びます。

私たちは特にバイオメディカルイメージングの分野と、自己組織化ナノ粒子造影剤の開発に関心を寄せてきました。臨床応用の成功には、凝集体の安定性、高コントラスト、そして自己組織化造影剤の排泄能の間の絶妙なバランスが極めて重要となります。自己組織化ビルディングブロックの分子構造のわずかな変化が、超分子重合のメカニズムに根本的な違いをもたらし得ることに気づいたとき、私たちは初めて特性評価手法を組み合わせるというアイデアを得ました。本手順の実演は、トロヴァン工科大学の cryo 10 施設の責任者であり、専門家である Paul Beaumont が行います。

記述されたプロトコルに従い、100 millimolar クエン酸緩衝液中での BTA ガドリニウム DTPA 溶液を調製して、本プロトコルを開始してください。このビデオに合わせて、1 centimeter UV Qキュベットにその溶液を満たします。キュベットを円形二色計（circular dichroism spectrometer）のキュベットホルダーに挿入します。

230から350ナノメートルの範囲でCDスペクトルを測定します。次に、CD強度が最大となるバンドにおいて、363から283ケルビンの温度範囲で、1分あたり1ケルビンの速度でCD冷却曲線を測定します。その後、BTAガドリニウムDTPAのクエン酸緩衝液に、2 Mの塩化ナトリウム緩衝液を同量加えます。

これにより、イオン強度が1 Mの塩化ナトリウムまで上昇し、ディスクの濃度は半分に希釈されます。イオン強度を上げた後、溶液を40秒間ボルテックスし、230から350 nmの範囲でCDスペクトルを再測定します。次に、CD強度が最も高いバンドにおいて、363 Kから283 Kまで1 K/minの速度でCD冷却曲線を測定します。

生のCDデータをOrigin 8.5にエクスポートします。最高測定温度におけるCD効果を0、最低測定温度におけるCD効果を1と定義してスペクトルを正規化します。CD効果の大きさは凝集度に比例するため、正規化したCD曲線は凝集度に比例します。正規化されたデータは、Origin Pro 8.5の非線形曲線フィッティングオプションを用い、温度依存性自己組織化モデルでフィッティングを行います。

このモデルでは、核形成領域と伸長領域が区別されます。まず、伸長領域における凝集度をフィッティングします。この方程式において、Tは変数温度を表します。

PHI N は凝集度に比例する正味のヘリシティであり、HE は伸長の分子エンタルピーです。T TE は伸長温度を表し、これは自己集合が熱力学的に有利になり始める温度です。正規化係数 fiat は、凝集度が上限を超えないという制約に基づき、Phi N / fiat が 1 を超えないようにするために導入されます。

Unity fittingを用いることで、特定の濃度における分子の自己組織化を特徴づける、J/mol単位の伸長エンタルピーおよびK単位の伸長温度を抽出できます。フィッティングを行う際は、方程式が伸長領域においてのみ有効であるため、TE以下の温度における凝集度のみをフィッティングさせるという制約に従ってください。最初の式をフィッティングさせた後、核形成領域の方程式における唯一の未知パラメータは、超分子重合の協同性を記述する活性化定数kaとなります。活性化定数を算出するには、核形成領域におけるTE以上の温度で実験的に得られた凝集度をフィッティングさせてください。

まず、本文に記載されている通り、電子顕微鏡用の溶液を調製します。簡潔に説明すると、100 mMクエン酸緩衝液と、5 M塩化ナトリウムを溶解させた100 mMクエン酸緩衝液の2種類の緩衝液を調製します。調製した各緩衝液0.1 mLにBTAガドリニウムDTPAを溶解させ、最終濃度が1 mMになるようにします。次に、5 mAで40秒間動作させたC Resington 2 0 8カーボンコーティング装置を用いて、QuantiFoilカーボンコートグリッドのプラズマ処理を行います。

ガラス化処理は、TAM解析に適した光沢のある薄いISIS層を形成させるため、クライオ電子顕微鏡観察において極めて重要な工程です。自動化したFEI VitroBotを用いて、ガラス化の際にグリッド上に水溶液を塗布します。この工程では、サンプルをグリッドに塗布し、余分な液体をブロッティングして水溶液の薄膜を形成させた後、グリッドを液体エタンに極めて迅速に浸漬させることでガラス化を行います。

ガラス化後、処理したグリッドを液体窒素に転送して保存し、次にサンプルグリッドを同じく液体窒素で冷却されたオートローダーカセットに手動で転送します。次のステップは、カセットをTUE cryo Titan TEMオートローダーに挿入することです。TUE Cryo Titanは、300 kilovoltsで動作する電界放出銃を備えています。

TAM画像の記録には、経験と迅速な操作が必要です。これは、高エネルギー電子線が撮影中に試料に損傷を与えるためです。カラム後方にエネルギーフィルターを備えたCCDカメラを用いて画像を記録します。ガドリニウムは強い常磁性を持ち、それによってプロトン信号が著しく広がるため、ガドリニウムを反磁性のイットリウムおよびBT溶液で置換した別のディスクを使用しました。

DTPAを調製します。目標濃度1 mMを達成するために、分子量2,979 g/molのBT atrium DTPAが何mg必要かを算出します。算出された量のBT atrium DTPAを、D₂O中50 mMの脱塩コハク酸緩衝液に溶解させます。その後、得られた溶液を0.6 mL、Wilmad-LabGlass NMRチューブにピペッティングします。

Varian社製の5 mm I-D-P-F-Gプローブを装着したNova 500分光計のvariant unityに試料を挿入します。標準的な¹H NMRを記録し、90度パルスを適応させ、それに合わせてミキシング時間を最適化した後、本文で述べたDOI実験を行います。卵巣リファレンスプローブにおけるHDOの自己拡散を決定した後、DOIワンショットパルスシーケンスを用い、試料中の凝集体の拡散係数を決定します。これにより、流体力学的半径を算出することができます。

最後に、球状粒子の拡散に関するストークス・アインシュタインの式を用いて、凝集体の水力学的半径 RH を算出します。末端のガドリニウム DTPA 錯体のイオン性は、コアが伸長したロッド状の凝集体に重合するように設計されているdiscoモノマーの一次元的な成長にフラストレーションを導入します。引力と反発力の相互作用のバランスが、凝集体のサイズと形状を制御します。

粒子や溶液のサイズおよび形状を決定するための強力な手法が、シンクロトロン放射光です。小角X線散乱（SAXS）を用いて、クエン酸緩衝液に溶解させたガドリニウムDTPAのSAXSプロファイルを2つの異なる濃度で測定しました。

低Q領域において傾きがゼロに近づくことは、凝集体の形状の欠如と等方性を示しており、球状物体の存在を示唆しています。異なる濃度で測定されたデータに均一な単分散球状フォームファクタを適合させた結果、算出された半径は3.2 nanometersとなりました。単量体disco, BTAガドリニウムDTPAの算出幾何学的半径は3.0 nanometersであり、アスペクト比が1に近い凝集体の存在は、自己組織化した物体の球状形態とナノメートルサイズを裏付けるさらなる証拠となります。

プロトン拡散順序NMR分光法を実施した。DOSY NMRを用いることで、超分子凝集体の拡散係数を決定でき、そこから流体力学的半径を算出することが可能となる。重水素化コハク酸緩衝液中における、凝集した反磁性ダイクロイック増幅剤の拡散係数は、ストークス-アインシュタインの式により 0.69 × 10⁻¹⁰ m²/s と決定された。

球状サイズの個別の物体について、2.9 nanometersの流体力学的半径が算出されました。このサイズは、BTA gadolinium DTPAのSOXデータから得られた値と非常によく一致しています。1次元のスタック長の制御に成功したことは、cryo TEM顕微鏡写真によってさらに裏付けられました。

1 mM濃度のBTAガドリニウムDTPAは、直径約6 nmの想定通りの球状物体を生成し、これによりSAXSおよびDLSによる測定結果が裏付けられました。高いイオン強度におけるクライオ電子顕微鏡写真では、アスペクト比の高いロッド状の超分子ポリマーの形成が明確に観察されました。この結果に対する最も可能性の高い説明は、静電遮蔽であると考えられます。

形状は約6 nmの直径を持つ球状の凝集体から、直径6 nmで長さが数百 nmに達する細長い棒状へと変化します。ここでは、塩濃度を上昇させた際のBTA Gadolinium DTPAの室温CDスペクトルを示します。BTA gadolinium DTPAの濃度は、低イオン強度で8 × 10⁻³ mM、高イオン強度で4 × 10⁻³ mMです。

CD測定では大幅に低い濃度が適用されていますが、明瞭なコットン効果は、マイクロモーラー濃度の条件下であっても完全な凝集体が存在することを示しています。塩濃度の上昇に伴いCDスペクトルの形状が変化しており、これはスタック周辺の反発相互作用が減少し、decosのパッキングが促進されたことを示す良好な指標となります。さらに、同一溶液のCD冷却曲線においても、形状に明確な差異が見られます。

塩濃度が高くなるにつれて、凝集が始まる温度はより高温側へと移行します。また、CD効果のより急激な上昇によって特徴付けられるように、協同的なメカニズムがより顕著になります。一方で、塩化ナトリウム濃度が0 Mのときの冷却曲線は、反協同的なプロセスを示すアイソスミック（ISO smic）自己組織化モデルで最も適切に記述されます。1.0 Mの塩化ナトリウムにおける冷却曲線は、協同的な自己組織化プロセスに典型的であり、0 Mおよび1 Mの塩化ナトリウムにおけるBTA gadolinium DTPAの自己組織化の熱力学的パラメータを定量化する核形成・伸長モデルによって記述することが可能です。

協同的なモデルを用いることで、無次元の活性化定数であるkaの減少が明確に示されます。KAの値が低いほど、自己組織化プロセスにおける協同性が高いことを示しており、これは高度に伸長した超分子ポリマーの形成として現れます。cryo TEMで観察されたように、実証された実験手法を試みる際は、実験手法を組み合わせることで初めて、調査対象である動的なナノ材料の有意義な全体像を記述できるということを忘れないことが重要です。

このビデオを視聴後、我々の複合的な実験アプローチがどの程度幅広く適用可能であるか、そして自己組織化ナノ材料およびスーパーポリマーの分野における重要な疑問を解決する上でどのように役立つかについて、十分に理解できているはずです。